实验三_植物叶片过氧化物同工酶的PAGE分析

实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳(PolyacryamidegelelectrophoresisPAGE)分离植物过氧化物酶同工酶1.目的要求(1)了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。(3)了解同工酶研究在理论和实践中的重要意义。PAGE实验中用到的试剂：简称化学名称作用Acr丙烯酰胺单体Bis甲叉双丙烯酰胺交联剂AP过硫酸铵催化剂TEMED四甲基乙二胺加速剂Tris三羟甲基氨基甲烷缓冲配对离子SDS十二烷基硫酸钠变性剂2.原理2.1生物大分子性质生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移方向取决与它们带电的符号。纸电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳2.2聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及有关特性2.2.1聚合反应聚丙烯酰胺是由单体(Acr)、交联剂(Bis)，在催化剂(AP或核黄素)和加速剂(TEMED)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。①丙烯酰胺（Acr）：是凝胶的最主要成分，单体聚合形成长链。②甲叉双丙烯酰胺(Bis)：是交联剂，将聚丙烯酰胺链交联成三维网状结构。③过硫酸铵(AP)或核黄素(Vb2)：提供自由基，引发聚合反应。④四甲基乙二胺（TEMED）：是加速剂，它催化过硫酸铵形成自由基。对核黄素引发的光聚合也有加速作用。化学聚合：使用AP作催化剂，常用于制备分离胶（小孔胶）。过量氧会影响链的延长和聚合，所以过硫酸铵(AP)催化的化学聚合要水封以隔O2。光聚合：使用核黄素作催化剂，聚合反应需光照，适用于制备浓缩胶(大孔胶)。应控制AP和TEMED的用量，使凝胶在40min-1hr之间聚合完全为宜。2.2.2凝胶孔径的可调性及其有关性质(1)凝胶性能与总浓度及交联度的关系：T%（Acr和Bis总浓度）=(a+b)/m×100C%(交联剂百分比)=b/(a+b)×100其中，a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积（ml）欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应控制a/b=30左右。经验公式:C=6.5－0.3T（2）凝胶浓度与孔径的关系：T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。T浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。核酸（RNA）〈104104～105105～2×10615～205～102～2.6表1分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度（%）蛋白质〈1041～4×1041～5×104～1×1051×105〉5×10520～3015～2010～155～102～5（3）凝胶浓度与被分离物分子量的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的分子量也不同.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳原理PAGE电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统2大类，本次实验利用不连续系统.PAGE不连续电泳胶由浓缩胶和分离胶组成，具有较高的分辨率，是因为在电泳体系中集“样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应”为一体。实验原理图1样品浓缩效应(1)凝胶孔径不连续性(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性(3)电位梯度的不连续性(1)凝胶孔径不连续性:浓缩胶T=3%孔径大分离胶T=7%或7.5%孔径小在2层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性:Tris:缓冲配对离子，维持溶液的电中性及pH值Cl-:在电场中迁移率快，前导离子(leadingion)，快离子。Gly:其pI=6.0，在pH6.7的浓缩胶缓冲体系中，甘氨酸解离度很小，因而在电场中迁移很慢，称为尾随离子（trailingion），慢离子。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质;因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面,然后再分成多个区带.大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动。(3)电位梯度的不连续性V(电泳速度)=E(电位梯度)8*m(迁移率)E高m慢≈E低m快由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。2分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面;反之，则阻力大，移动慢，走在后面。分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。3电荷效应进入pH8.9的分离胶中，各种蛋白质所带净电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷多，则迁移快；反之，则慢各种蛋白质按电荷多少、分子量及形状，以一定顺序排成一个个条型的区带，从而达到分离的目的。2.4植物过氧化物酶同工酶的测定原理(1)植物同工酶凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同的一组酶称同工酶，即酶蛋白本身的分子结构组成有所不同的一组酶。植物组织中的同工酶（isoenzyme）是基因表达的产物。每一种植物都有相同的遗传信息，其表达产物与植物的发育和所处的环境有十分密切的关系，植物不同组织和器官有不同的形态特征和化学组成，从而合成不同的酶蛋白。在研究植物基因调控与生长发育、与环境条件的关系以及许多生理生化和遗传问题时，常常需要分析同工酶谱的差异。这类酶存在于生物的同一属、种、变种，或同一个体的不同组织、细胞中，因而，可以通过对它们的分析，并以其多态性作为遗传标记，研究种质资源的亲缘关系、重要性状的同工酶表现等。例如，人们用脂酶同工酶酶谱的特异性，鉴定了近缘野生莴苣（Lactucaserrila）与莴苣栽培种（L.sativa）的亲缘关系，以及南瓜属三个主要栽培种的亲缘关系。但是，同工酶在同一物种、同一个体的不同生长发育时期，其表现是不一样的，有一些同工酶的重现性较差，应用中也应当注意。一些重要的同工酶：过氧化氢同工酶超氧化物歧化酶同工酶酯酶同工酶淀粉酶同工酶乳酸脱氢酶同工酶等(2)过氧化物酶同工酶的测定过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。植物体内许多生理代谢过程常与它的活性及其同工酶的种类有关。利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有H2O2及联苯胺的溶液染色，出现蓝色或棕褐色产物的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶谱。3.试剂和样品1测试样品新鲜植物叶片。2试剂(1)分离胶缓冲液:3MTris（HCl）pH8.8(2)分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis）：4℃贮存，一般可放置1个月左右。(3)浓缩胶缓冲液:0.5MTris(HCl)pH6.7(4)浓缩胶贮液（10%Acr-2.5%Bis）:4℃贮存，一般可放置1个月左右。(5)Tris-Gly电极缓冲液pH8.3注意：Acr和Bis是对中枢神经系统有毒的试剂，操作时应避免直接接触和吸入它的粉末。(6)40%蔗糖溶液(W/V)。(7)TEMED(浓度≥98%)(8)0.14%过硫酸胺（AP）：4℃贮存仅能用一周，最好当天配制。(9)0.1%溴酚蓝指示剂(10)联苯胺染色母液：联苯胺1g+冰醋酸18ml+H2O2ml溶解储于棕色瓶中。注意：（1）联苯胺的毒性很强，其固体和蒸气都能通过皮肤迅速进入体内，引起恶心、呕吐，损害肝和肾脏。联苯胺及它的盐都是致癌物质。（2）联苯胺染色液要当天配制。4.操作方法4.1制胶架装配4.2分离胶制备7.5％，配12ml，混合后的凝胶溶液，用枪加至两层玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约0.5cm，上覆盖1－2mm高的蒸馏水或水饱和的异丁醇，用于隔绝空气，使胶面平整，静置30分钟-1小时使其聚合。4.3浓缩胶制备4%，配4ml，混合均匀后用枪将凝胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，插入加样梳，梳齿下不要有气泡存在，光下静置30分钟-1小时使其凝合。7.5%分离胶和2.5%浓缩胶的配方试剂用量（ml)7.5%分离胶2.5%浓缩胶分离胶缓冲液(PH8.8)1.530%分离胶贮液3.0浓缩胶缓冲液(PH6.7)0.510%浓缩胶贮液1.0ddH2O1.50.50.14%过硫酸胺（AP）6.02.0TEMED0.0040.0024.4将完成聚合的胶板由制胶架上取下，安装到电极组件上，带凹槽的内板面向U形硅胶框，两侧用夹子夹紧。一个电极组件可同时带两个胶板。在胶板与电极组件之间的内槽中加入1X的稀释电极液（pH8.3）至超过内板0.5cm，但不要漫过电极组件.在底盘中加入电极液至没过胶板底缘0.5cm.每组需配1X的稀释电极液（pH8.3）250ml4.5制备样品（过氧化物酶的提取）称取1g待测植物新鲜样本置于冰浴上的研钵内，加入1ml0.05mol/lTris-HCl缓冲液（PH6.7）研成匀浆，转入离心管，再用2ml前述溶液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，12000rpm离心5min，其上清液即为酶的提取液，供电泳分析用。4.6加样石楠叶S140μl+40%蔗糖40μl，混匀，分3孔：10、20、30μl楫木叶S240μl+40%蔗糖40μl，混匀，分3孔：10、20、30μl桂花叶S340μl+40%蔗糖40μl，混匀，分3孔：10、20、30μl加样时.用枪分别取10、20、30μl样品蔗糖混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到三个凝胶凹形样品槽内在第一个样品槽加５μl溴酚蓝作为指示剂上样与电泳4.7电泳：正确连通电泳仪与电泳槽(电极红红，黑黑，切勿接错)，打开电泳仪开关，将电压调至90V，稳压。待样品进入分离胶时，将电压调至150V。当蓝色染料迁移至距离胶板下缘0.5cm时，将电压调回到零，关电。倒掉电极液，取下胶板，用牛角勺柄轻轻将一块玻璃板撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。注意：为保持同工酶的活性，要将电泳槽接上冷却水。4.8染色取1.5ml联苯胺母液+28.5mlH2O＋0.03ml30%H2O2。混匀后倒入盛有凝胶的培养皿．此时可以看到胶条上出现蓝色或棕褐色条带，即过氧化物酶带，约2~5min后用自来水冲洗，这时蓝色带也慢慢变成棕褐色。联苯胺有毒，该步骤应戴手套操作4.9实验结果分析：清洗干净的凝胶用凝胶成像仪照相记录实验结果，并计算各同工酶的相对迁移率。