总糖和还原糖的测定及葡萄糖标准曲线的绘制-3,5-二硝基水杨酸法

实验一、总糖和还原糖的测定——3,5-二硝基水杨酸法一、实验目的1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理；2、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。二、实验原理还原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖；利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来；对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。NaOH黄色棕红色加热在过量的NaOH碱性溶液中，3-氨基-5-硝基水杨酸呈橘红色，在540nm处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值成线性关系。利用比色法，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。三、实验器材1、材料：山芋粉2、仪器：电子分析天平、水浴锅、V-1100可见分光光度计、移液器3、其他：试管、容量瓶、三角烧瓶、量筒、吸管（移液管）、洗耳球、玻棒、洗瓶、漏斗、离心管、六凹反应盘、pH试纸（1～14）四、实验试剂1、标准葡萄糖溶液（1.0mg/ml）2、DNS试剂3、6mol/LHCl4、6mol/LNaOH5、I2-KI溶液五、操作1、样品中还原糖的提取准确称取0.5g山芋粉置于100ml三角烧瓶中加3ml蒸馏水，调成糊状再加30ml蒸馏水50℃水浴，30min(不时搅拌)转移至50ml离心管中，4000rpm，5min上清液1沉淀加20ml蒸馏水，洗涤沉淀，4000rpm，5min上清液2沉淀(弃)置于容量瓶中，蒸馏水定容至100ml,混匀，取1ml即可进行还原糖的测定。2、样品中总糖的水解、提取准确称取0.2g山芋粉置于100ml三角烧瓶中加3ml蒸馏水，调成糊状再加12ml蒸馏水，5ml6mol/LHCl沸水浴，30min(不时搅拌)取1～2滴于六凹反应盘中，加1滴I2-KI溶液，如果完全不显蓝色，即可进行下面的操作。冷却至室温用6mol/LNaOH调pH7.0（pH试纸）蒸馏水定容至100ml,混匀滤纸过滤，取10ml滤液用蒸馏水定容至100ml，成稀释1000倍的总糖水解液，混匀,取1ml总糖水解液，测定其还原糖的含量3、制作葡萄糖标准曲线及还原糖、总糖含量的测定。取8支洁净的试管，分别用记号笔标上0～7号，按照下表进行操作。其中0～5管，用于标准曲线的制作,以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线（用Excel表制作）。管号试剂01234567标准葡萄糖溶液/ml00.20.40.60.81.01.01.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.2000DNS试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温蒸馏水/ml9.09.09.09.09.09.09.09.0葡萄糖含量/mg00.20.40.60.81.0C1C2A540nmab六、计算C1V1ω(还原糖)=——×100%m1C2V2ω(总糖)=——×0.9×100%m2附：相关仪器使用1、移液管的使用2、移液器的使用3、离心机的使用注意配平，对称放4、V-1100可见分光光度计的使用比色皿V-1100可见分光光度计开机预热30min测吸光度选择波长（540nm）MODE键切换到T，将黑体放入光路中合上盖，0键校零MODE键切换到A，参比液放入到光路中合上盖，100键调零将待测液依次放入到光路中，即可得出待测液的吸光度。比色皿的使用