质粒种类与应用

克隆载体基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。基因载体应具备的条件：（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；（2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；（3）有一定容量；（4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点质粒(plasmid)Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。Plasmidchromosome质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA质粒DNA的分子量范围：1-300kb质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-3拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒10-60拷贝stringentplasmid质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coliColE1plasmid复制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒质粒的基本特征质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成不相容性群质粒质粒的基本特征质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒的基本特征质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定20060421质粒质粒的基本特征携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义质粒质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr质粒质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000扩增基因低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。发展概况pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。pBR322有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制pBR3224363bpOriginofReplicationROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR322：氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板重组DNAAmprTcs提取DNA电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化无菌落阳性菌落筛选重组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切pUC质粒系列pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRIIIIHIIIIIdIIIpUC18pUC19HinSphPstSalXbaBamSmaKpnSacEcodIIIIIIIHIIIIRIApOriLacZ(2.68kb)r476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列，表达半乳糖苷酶的α片段。LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。lacZ之内是M13的多功能连接器。三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’BamHIpUC182686bpAprlacZ'oriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的-肽段bOHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galpKO系列组成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位点包括terr，.表达产物催化Gal+ATPGal-1-P+ADP以14C标记的半乳糖作底物,检测生成的*Gal-1-P的放射性。在Galk基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算启动子功能的强弱。如在Galk基因前插入目的基因，与无插入的空载pKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖乳糖类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。LacZ基因编码的乳糖苷酶X-gal蓝色吲哚产物蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）诱导物ZYXPOZYXPO乳糖标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLacZ蓝色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因C端序列LacZ酶基因克隆时的定向插入插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正确转录，这种构建方式称为定向插入。EcoRIHindIIIOri复制起点LacZAPRpUC19质粒质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间质粒质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs质粒质粒DNA的分离纯化碱溶法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNAcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA质粒质粒DNA的分离纯化沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性