第十一章 动物细胞培养基础知识

第十一章动物细胞培养基础知识主要内容实验室设置常用器具的清洗消毒方法动物细胞培养用液一、实验室设置基本实验室：准备室+接种室+培养室辅助实验室：细胞学实验室+生化分析室二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗（1）玻璃器材：初次使用的玻璃器皿：洗涤剂/肥皂水洗涤1~5%HCl浸泡过夜蒸馏水洗2~3次使用过的玻璃器皿立即浸入水中待洗一般玻璃仪器：肥皂水/洗涤剂洗涤蒸馏水洗涤2~3次量器：铬酸洗液浸泡4~6小时蒸馏水洗涤2~3次二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗（2）橡胶器材初次使用：0.5mol/LNaOH15min0.5mol/LHCl15min自来水煮沸蒸馏水煮沸20min用过的橡胶制品：同玻璃器材的清洗二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗（3）塑料器皿2%NaOH浸泡过夜2~5%HCl浸泡30min蒸馏水洗（4）金属器皿洗衣粉洗涤蒸馏水洗酒精棉球擦拭晾干二、常用器具的清洗消毒方法2、消毒物理：热力灭菌、电离辐射、紫外灭菌化学：重金属盐、氧化剂、表面活性剂生物：抗生素三、动物细胞培养用液培养基平衡盐其他（杂用液）（一）、培养基1、组成成分糖：葡萄糖无机离子与微量元素：如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒氨基酸：12种必需氨基酸，精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸。Ｌ型。（一）、培养基1、组成成分：维生素：至少8种，生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素Ｂ12。促生长因子及激素：如胰岛素（insulin），它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。（一）、培养基2、pH：大多数细胞的适宜pH为7.2～7.4,一般不能超过6.8~7.6。造成培养基pH波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2,在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。（一）、培养基2、pH：调节：使用NaHCO3-CO2缓冲系统（合成培养基中，或Hepes），再通过稳定调节培养箱中CO2气体的浓度（5%）,使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。NaHCO3＋H2O←→Na++HO-+H2O+CO2↑当[CO2]能够保持相对稳定时，上述反应就可达到平衡，[OH－]也相对恒定，即pH相对恒定。（一）、培养基3、分类天然培养基合成培养基（一）、培养基（1）、天然培养基天然培养基：主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立的早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。天然培养基含有丰富的营养物质，渗透压、pH等也与体内环境相似，但制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前仍然广泛使用的天然培养基是血清（serum），另外组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞时也不可缺少。（一）、培养基（1）、天然培养基血清的种类：主要是牛血清，在培养某些特殊细胞时也用人血清、马血清等。牛血清还分为小牛血清、新生牛血清和胎牛血清。一般使用的为小牛血清，小牛血清取自出生10～30天的小牛。（一）、培养基（1）、天然培养基血清的质量标准：血清质量的鉴定一般包括理化性质：如渗透压、pH，球蛋白、血红蛋白含量越低血清质量越高。微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等促生长效果检测：克隆形成率测定法和连续传代培养测定法。（一）、培养基（1）、天然培养基血清的使用与储存：大部分血清在使用之前必须经过灭活处理，即56℃放置30分钟。（灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生细胞毒作用。灭活也会损失一些对细胞有利的成分如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养）储存条件：血清一般储存于-20℃，同时应避免反复冻融。可灭活后分装，使用时4℃融化。（一）、培养基（1）、天然培养基血清使用的缺点：批次差异。鼠尾胶原：它的主要作用是促进细胞的贴壁，特别是对上皮类细胞。组织浸出液：Hank’s浸30min（一）、培养基（2）、合成培养基基本培养基无血清培养基无蛋白培养基（一）、培养基（2）、合成培养基①基本培养基：最初研制合成培养基，就希望使其完全替代天然培养基，但结果却没有象人们所预期的那样，许多合成培养基都只能使体外培养细胞短暂生存，只有在添加了少量天然培养基（血清）之后，细胞才能在其中长期生长繁殖。这类合成培养基称为“基本培养基”或“通用培养基”，在添加了一定比例的血清之后，称之为“完全培养基”。（一）、培养基（2）、合成培养基①基本培养基：常用基本培养基199培养基低限量基础培养基（minimumessentialmedia,MEM）DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium)IMDM(Iscove’smodifiedDulbecco’smedium)：适合于细胞密度较低、生长较困难的情况RPMI1640（一）、培养基（2）、合成培养基②无血清培养基虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养实验的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，又如测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力。无血清培养基：基础培养液+添加组分。（一）、培养基（2）、合成培养基②无血清培养基添加组分包括以下几大类物质：促贴壁物质：一般是细胞外基质，如纤连蛋白（FN）、层粘连蛋白(LN)等。促生长因子及激素酶抑制剂：最常用的是大豆胰酶抑制剂。结合蛋白和转运蛋白：常见的有转铁蛋白和牛血清白蛋白。微量元素：硒是最常见的（一）、培养基（3）、无蛋白培养基(proteinfreemedium，PFM)不含动物蛋白的培养基。添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。（4）、限定化学成分培养基(CDM)：是指培养基中的所有成分都是明确的，它不含有动物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。（二）、平衡盐溶液平衡盐溶液：（balancedsaltsolution,BSS）主要由无机盐、葡萄糖组成。作用：具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用提供细胞生存所需的能量和无机离子成分用于洗涤组织、细胞配制各种培养用液（二）、平衡盐溶液几种常用的平衡盐溶液：RingerPBSTyrodeEarleHank’sD-Hank’sDulbecco（三）、其他培养用液1、消化液胰酶溶液（0.1%~0.5，pH8.0）胶原酶溶液（0.1～0.3mg／L或200U／mL，pH6.5）EDTA溶液（0.02%）上述溶液可混合使用（三）、其他培养用液2、pH调整液NaHCO3溶液（常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液）HEPES液（HEPES是一种弱酸，中文名称是羟乙基哌嗪乙硫磺酸，使用的终浓度为0.01～0.05mol/L；可维持pH在7.0左右）。（三）、其他培养用液3、谷氨酰胺补充液谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，是合成培养基的重要成分。由于谷氨酰胺容易降解，所以都是在使用前添加。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液，配制时应加温至30℃，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于-20℃。（三）、其他培养用液4、抗生素液常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”。青霉素主要对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。青霉素使用的终浓度为100000U/L，链霉素使用的终浓度为0.1g/L。一般配制成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。三、培养物的污染及防止按现代的观念，凡是混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。根据这一概念，组织培养污染物应包括生物（真菌、细菌、病毒和支原体）化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分）细胞（非同种的其他细胞）。其中以微生物最为多见。另外，随着使用细胞种类增多，不同细胞交叉污染，尤其是Hela细胞的污染也时有发生，从而造成细胞不纯。三、培养物的污染及防止一、污染途径1空气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面，造成污染。2器材：各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染3操作：实验操作无菌观念不强，培养两种细胞以上时，交叉使用吸管或培养液、瓶等有可能导致细胞交叉污染。4血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。5组织样本三、培养物的污染及防止污染对培养细胞的影响培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复。污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分类象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强细胞浆出现颗粒；污染较严重，细胞增值停止，分裂象消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。三、培养物的污染及防止细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。检测：取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml，将细胞放培养箱培养。当污染细菌时，培养系统中产生大量细菌，几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。三、培养物的污染及防止真菌污染对细胞的影响及污染物的检测微生物污染中以真菌最多，真菌污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。三、培养物的污染及防止支原体污染对细胞影响及污染物的检测细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题，是细胞培养最常见的、干扰试验结果的一种污染。研究表明，95％以上是以下四种：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。支原体污染细胞后，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。三、培养物的污染及防止支原体污染对细胞影响及污染物的检测支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如β-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮。三、培养物的污染及防止细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测细胞培养中，细胞间交叉污染并不罕见，多是由于在培养中操作时各种细胞同时进行，混杂使用器皿和液体所致，这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化。常用观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。三、培养物的污染及防止污染的预防:1.器皿准备中的预防：严格消毒，做到真正洁净；2.开始操作前的预防：定期清洗或更换超净台的空气滤网，检查新配置的培养液，确认无菌方可使用；操作前提前半小时启动超净台的紫外灯消毒；操作应戴口罩，消毒双手。3.操作过程中的预防；主要包括：超净台内