2XAllinOne(tm)Q-PCRMixcdr

使用说明书TM×AllinOneQ-PCRMix2本产品是采用PCR技术结合SYBRGreenI嵌合荧光法进行现时荧光定量PCR(Real-TimePCR)的专用试剂，产品中包含DNA聚合酶、反应Buffer、dNTP和SYBRGreenI，使用时只需加入模板和引物即可进行Real-TimePCR实验，操作快捷方便。本产品适合现有市场上几乎所有Real-TimePCR仪，产品附带的ROXReferenceDye可以使用于需要ROX参比荧光的仪器。■产品概述■产品原理1、PCR技术本产品中的DNA聚合酶是经特殊修饰的DNA聚合酶，此热启动酶结合优化的反应Buffer能有效地抑制非特异扩增产物的产生，极大地提高了PCR的扩增效率和检测灵敏度。2、SYBRGreenI嵌合荧光SYBRGreenI是一种荧光染料，能特异地掺入到DNA双链分子的小沟部位，发出荧光信号。在PCR反应体系中，SYBRGreenI染料与DNA双链分子结合发出荧光，通过检测反应进程中SYBRGreenI的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。同时在PCR结束后可以直接进行融解曲线分析，从而判断是否存在着变异或非特异性扩增产物。此产品应在℃避光保存，避免在4℃或室温存放。使用前请缓慢颠倒混匀试剂，避免起泡，并经短暂离心后再使用。配制PCR反应液时请使用PCR级水，同时避免强光照射。核酸扩增污染，请严格遵守标准PCR流程。1、-202、3、4、为尽可能减少■注意事项TM取出2×AllinOneQ-PCRMix（如有必要，取出50×ROXReferenceDye），上下轻缓颠倒混匀，在配制前进行短暂离心。1、■操作说明GeneCopoeiaInc.www.genecopoeia.com19520AmaranthDriveGermantown,Maryland20874USATel:301-515-6982;1-866-360-9531Fax:[phone]Web:产品内容TM2×AllinOneQ-PCRMix×50ROXReferenceDye保存条件：-20℃产品套装编号:D0101A,本套装包含以下产品:产品编号D01010AD01011A包装规格1ml×2(200次反应)80µl2、PCR反应液配制(例)（冰上操作）×2ddHO2PCRForwardPrimer（4µM）PCRReversePrimer（4µM）TemplateTotalTMAllinOneQ-PCRMix试剂组分体积终浓度10μl1μl2μl2μl5μl20μl1×0.4μM0.4μMTM*将AllinOneQ-PCRMix设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适当比例调整。如果要变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。*引物是Real-TimePCR的重要因素。在引物设计时，建议使用Oligo、PrimerPremier等引物设计软件。在PCR反应时，引物浓度通常在0.2µM至0.6µM范围内调整，一般浓度为0.4µM时能得到较好的结果。扩增效率不高时，可适当增加引物用量,但引物太多，可能会导致非特异性扩增产物增加。*DNA模板的添加量通常在100ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因拷贝数不同，必要时可以进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如使用反转录cDNA作为模板，请稀释后再使用。原液也可以用，但cDNA反转录体系对定量可能会产生影响。充分混匀PCR反应液，添加至PCR反应管中。进行短暂离心，确保所有试剂流到反应管底部。×23、4、5、PCR反应程序，建议使用标准的三步法：140循环数步骤温度95℃95℃55℃~60℃72℃offoffoffon时间检测预变性变性退火延伸10min10sec20sec15sec对于利用SYBRGreenI检测的Real-TimePCR都需要进行融解曲线分析，所以PCR循环结束后要求立即进行融解曲线分析的实验设计，下面以Bio-Rad的Chromo4为例进行设计：温度72℃~95℃40℃onoff时间检测1sec/次1min*产品采用的DNA聚合酶为经过修饰的热启动酶，9510min充分激活酶活性。*退火温度应该结合引物的Tm在5560进行调整。引物结合的最佳值可能超出此范围，可以根据实际情况进行调整。*Real-TimePCR扩增的片段最佳长度为80~150bp，可以适当延长至300bp。℃能℃~℃温度间隔0.3℃根据实验设计进行必要的数据分析，具体操作参考所使用的仪器说明书。■数据分析■实验示例TMAllinOneQ-PCRMix102bp实验目的：通过梯度稀释质粒DNA，制作标准曲线，来判定的扩增效率和检测灵敏度，其中检测片段长度为。使用仪器：Chromo4(Bio-Rad)操作流程：51、将质粒按10的倍数稀释成10分子/µl~1分子/µl共6个浓度梯度。2、配置PCR反应液（冰上操作）×2PCRforwardPrimer（4µM）PCRReversePrimer（4µM）ddHO2反应液mixTMAllinOneQ-PCRMix试剂组分体积10μl2μl2μl1μl15μl3、充分混匀PCR反应液mix，短暂离心后添加至PCR反应管中。4、添加稀释后的质粒模板5µl至各个反应管中，阴性对照使用5µl的灭菌水替代模板。5、设置反应条件及其融解曲线读取条件：PCR145循环数步骤温度95℃95℃56℃72℃72℃~95℃40℃offoffoffononoff时间检测预变性变性退火延伸融解曲线读取冷却10min10sec20sec15sec0.3℃/次.sec1min6、实验结束后，分析扩增曲线及其融解曲线：质粒DNA梯度稀释扩增曲线扩增产物融解曲线峰7、由各扩增曲线所得到的Ct值，进行标准曲线的制作。标准曲线图8、实验结论从扩增曲线及其融解曲线峰分析可知：以质粒DNA为模板，可以检测到低至个分子5TM的拷贝数，产物单一，说明AllinOneQ-PCRMix具有极高的检测灵敏度；同时从标准曲线可以看出其检测的各个浓度间线性关系良好，说明其具有优良的扩增效率。■常见问题及对策********A如果空白对照所对应融解曲线的Tm与阳性对照一致，说明反应体系可能有污染或其为阳性样品，为此应首先排除其是否为加样误差，如仍有相同情况，应更换TM级水、引物或启用新的。AllinOneQ-PCRMixB如果空白对照所对应融解曲线的Tm值比阳性对照低，说明可能产生了引物二聚体等的非特异性扩增。为此建议PCR反应液配置应在冰上进行，并提高荧光检测时的温度。如不能改善，应重新设计引物。*阳性对照的融解曲线出现双峰或多峰阳性对照的融解曲线出现双峰或多峰现象，说明产生了非特异性扩增片段。建议PCR反应液配置应在冰上进行，并提高退火温度，如不能改善，应重新设计引物。***1、扩增曲线混乱荧光检测时的温度设定不恰当，请调整到合适的温度。样品位置设定错误，请设定正确的样品位置再进行分析。PCR循环条件、引物浓度、序列等不恰当，请调整引物浓度或改善退火温度进行尝试，仍不能改善结果，建议重新设计引物。样品纯度不好，应对样品进行苯酚抽提或乙醇沉淀等方法进行纯化处理，如果样品为cDNA，最好稀释后再用，因为反转录体系对PCR反应有一定的影响。2、定量值重复性差仪器故障，因为仪器的不适用，在温度的管理或检测方面重复性差，应根据相应仪器的说明书进行检测。样品纯度不好，不纯的样品会导致实验的重复性差，请使用纯化过的DNA样品，并在使用前充分混匀样品，对于cDNA样品，最好稀释后再用。PCR循环条件、引物浓度、序列等不恰当，扩增效率差的PCR反应容易产生重复性差的结果，请调整引物浓度或退火温度来提高扩增效率，扩增不好时，应尝试降低退火温度或提高引物浓度，仍不能改善建议重新设计引物。3、融解曲线异常空白样品中有信号PCRPCR×24、无信号值（Ct）出现或出现较晚反应循环数不够。一般为35个循环以上，但高于45个循环会增加过多的背景信号。模板量不足、降解或模板中所检测序列含量低。建议对未知浓度的样品应从系列稀释品的最高浓度做起，同时避免反复冻融样品。样扩增效率低，反应条件不够优化。建议设计更好的引物，优化反应条件。生产经销商:复能基因FulenGen广州复能基因有限公司广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D区8楼(邮编:510663)技术热线:020-32068595电子邮箱:[e-mail]网址:www.fulengen.com