2×TaqPCRMasterMix含染料PT102

2×TaqPCRMasterMix含染料PT102-01PT102-022×TaqPCRMasterMix1ml5×1mldiH2O1ml5ml不含染料PT103-01PT103-022×TaqPCRMasterMix1ml5×1mldiH2O1ml5ml●储存条件-20°C长期保存；反复冻融16次不影响使用效果；如果频繁使用，建议储存于4°C。上海莱枫生物科技有限公司www.lifefeng.com电话：[phone]传真：[phone]技术支持：13817902990●产品简介2×TaqPCRMasterMix是一种优化的两倍浓度的PCR预混合液。适合用于常规PCR，可以从复杂基因组DNA中扩增出长达4kb的片段或者从λDNA中扩增出长达5kb的片段。PCR增强剂和蛋白稳定剂协同提高了PCR效率和灵敏度，非常适合低拷贝模板扩增。产品使用方便，只需要取0.5倍PCR体系体积的2×TaqPCRMasterMix，加入引物和模板，以diH2O补足体积即可，大大减少了加样误差。产品分为含染料(目录号：PT102)和不含染料(目录号：PT103)两种，含染料的产品反应结束后可以直接电泳。●产品主要成分0.1U/µlTaqDNAPolymerase0.4mMeachdNTPs2×TaqBuffer红色和黄色两种指示染料(目录号：PT102)PCR增强剂和蛋白稳定剂△TaqDNAPolymerase重组的耐热的DNA聚合酶，具有5′→3′的聚合酶活性和双链5′→3′的外切酶活性，产物为3′单个A粘性末端。△2×TaqBuffer2×TaqBuffer含KCl，(NH4)2SO4，3mMMgCl2，Tris-HCl，pH8.3(25°C)。△指示染料目录号：PT102含红色和黄色两种电泳指示染料。两者不会抑制PCR，也不会抑制酶切和连接等下游酶反应，不会影响EB显色，其电泳相对迁移距离见表1：表1：琼脂糖凝胶浓度与染料相对迁距离凝胶浓度红色染料黄色染料0.8%2000bp~80bp1.0%1500bp~40bp1.5%1000bp~20bp2.0%500bp10bp2.5%350bp10bp3.0%200bp10bp染料会干扰OD检测。如果PCR产物不做纯化而直接检测OD，请使用目录号：PT103。●质量控制经检测无外源核酸酶活性，PCR方法检测无宿主DNA残留，能有效扩增人类基因组中的单拷贝基因。●PCR体系成分△模板DNA的纯度很多残留的核酸提取试剂会影响PCR反应，包括蛋白酶、蛋白变性剂(比如SDS、胍盐)、高浓度盐(KAc、NaAc、辛酸钠等)和高浓度EDTA等。这些杂质可通过乙醇或异丙醇沉淀后用66-70%乙醇洗涤两次去除，大部分商品化的核酸纯化试剂盒可有效去除这些杂质。cDNA作为模板时，应考虑模板中高浓度盐离子(尤其是Mg2+)；PCR产物作为模板还需考虑DNA含量(参考△模板DNA用量)。高纯度、高浓度的DNA作为PCR模板是最理想的。高浓度DNA可通过稀释减少干扰PCR的成分。△模板DNA用量极微量的样品可以作为PCR摸板，但为保证反应的灵敏性，25µl体系使用104拷贝的靶序列作为模板；可参考表2计算需加入PCR体系的模板量。表2：1µg各种来源的DNA对应的摩尔数1µgDNAmol1kb线性双链DNA9.18×10113kb质粒DNA2.9×1010Lambda(λ)DNA1.9×1010E.coli基因组DNA2.0×108人类基因组DNA3.0×105例如：纯化的人类基因组DNA浓度为1µg/µl，某基因在人类基因组中拷贝数为10，其单位体积拷贝数为：3.0×105mol/µg×1µg/µl×10copy/mol=3.0×106copy/µl1×104copy/(3.0×106copy/µl)=1/300µl即：1/300µl浓度为1µg/µl的人类基因组DNA中含104拷贝该基因，稀释300倍后加1µl至25µlPCR体系。为保证反应的特异性，DNA终浓度应小于10ng/µl，过多的DNA可能会出现涂抹带甚至无特异性条带。一些特定的模板可参考表3决定模板量。表3：25µlPCR体系特定模板用量特定模板25µlPCR体系用量cDNA2.5µl(10%PCR体系体积)PCR产物用TE＃稀释100~1000倍后，1µl菌液用TE＃稀释100~1000倍后，1µl菌落分散于0.1~1mlTE＃，1µl＃TE:10mMTris,pH8.0(25°C),1mMEDTA。TE有利于DNA储存，溶于TE的模板用量不可超过PCR体系的体积的10%，因为EDTA会螯合Mg2+而抑制酶活性。如果稀释后的模板只需短时间储存，建议用去离子水稀释。△引物浓度一般每条引物配制的浓度为10µM(50×)，工作浓度为0.2µM。引物过量可能会出现非特异性扩增，引物过少可能会降低扩增效率。●PCR参数设置△预变性一般预变性为94°C，1~5min。变性温度过高或时间过长都会损失TaqDNAPolymerase活性。△退火退火温度是PCR的关键，温度过高可能降低产量，温度过低可能产生引物二聚体或非特异性扩增。初次使用一对引物时可尝试低于Tm5°C(如果两条引物Tm不同，参考较低的Tm)作为退火温度。一般引物合成公司会提供所合成引物的Tm，也可以根据此公式估算引物Tm：Tm=2°Cx(A+T)+4°Cx(G+C)。最佳退火温度需要进行梯度PCR确定。如果有非特异性扩增，请参考●提高PCR特异性的方法。△延伸延伸温度通常为72°C，延伸时间长短取决于目的DNA片段长度，以1kb/min计算所需延伸时间，时间过长可能会导致非特异性增加。循环结束后，继续延伸5~10min，以获得完整的双链产物。△循环数一般使用25~35个循环，低拷贝模板可适当增加循环数。过多的循环数不见得可以提高PCR产量，相反可能会增加非特异性扩增，减少特异性产物。●提高PCR特异性的方法△使用适量的模板DNA请参考●PCR体系成分△模板DNA用量。△递减PCR(TouchDownPCR)PCR起始的几个循环使用严紧的退火条件。虽然扩增效率低，但靶序列特异性最高，被优先扩增，其产物在后续循环中继续占优势，从而提高特异性。退火温度从高于Tm5°C开始，每个循环递减，直到低于Tm5°C；一般用10个循环，每个循环降低1°C。之后用低于Tm5°C作为退火温度，再进行20个循环。△巢式PCR(NestedPCR)用两对引物进行两次PCR。第一对引物(外引物)从多个靶位点扩增产生特异性和非特异性产物。第二对引物(巢式引物)位于第一对引物内侧，只能与第一次PCR产生的特异性产物互补(因为同时能与两对引物互补的非特异序列极少)。即：第一次PCR产生的特异性产物在第二次PCR中占绝对优势被扩增。一般，第一次PCR用15~20个循环，其产物稀释100~1000倍后作为模板进行第二次PCR。●使用方法1.PCR成分准备将2×TaqPCRMasterMix、模板DNA和引物室温解冻，置于冰上。Mix解冻后需上下翻转混合均匀。2.PCR反应液配制(以50µlPCR体系为例)在冰上将以下各成分加入PCR反应管：模板DNA＊Primer1(10µM)1µlPrimer2(10µM)1µl2×TaqPCRMasterMix25µldiH2O补充至50µl＊请参考●PCR体系成分△模板DNA用量。注意：尽可能使用合适精确度的加样器，并且避免加样体积小于1µl(可按适当比例稀释后加样)。3.手指轻弹PCR反应管充分混匀，简短离心。4.PCR反应循环设置举例94°C3min94°C30sec55°C※30sec30cycles72°C1min§72°C5min4°Csoak※以实际最佳退火温度为准。§以1kb/min计算。