第三章 动植物细胞培养产酶

第三章动、植物细胞培养产酶定义：动、植物细胞培养是通过特定技术获得优良的动、植物细胞，然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养，以获得所需产物的过程。一、动植物细胞中酶生物合成的调节1.细胞分化改变酶的生物合成（如端粒酶）2.基因扩增加速酶的合成3.增强子促进酶的生物合成4.抗原诱导抗体酶的生物合成二、植物细胞培养产酶与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。1.植物细胞的特性植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um200～3001～1010～100倍增时间/h﹥120.3-6﹥15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要求不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感非常敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、单克隆抗体、酶等2.培养基特点应用最广的是MS培养基和LS培养基常用的MS培养基和B5培养基的组成列于P73表3-33.培养工艺：——悬浮细胞培养⑴工艺流程外植体→细胞的获取→细胞培养→分离→纯化产物①外植体选择和处理选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用70%-75%乙醇，0.1%升汞消毒，无菌水漂洗。外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。愈伤组织：将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织外植体愈伤组织②植物细胞获取直接分离法愈伤组织诱导法原生质体再生法③细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反应器中进行培养④分离纯化：生化技术机械法酶法⑵培养条件的影响与控制①温度：室温25℃(有时需变温控制）②pH：微酸性范围。即pH5.0-6.0③溶解氧的调控：通气与搅拌④光照的控制：强度和时间有一定要求⑤前体的添加（饲喂）⑥刺激剂的应用4.植物细胞培养产酶实例以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例(1)大蒜愈伤组织的诱导选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L2,4-D（二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L6-BA（苄基腺嘌呤）的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。(2)大蒜悬浮细胞培养将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养10-12d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。(3)酶的分离纯化细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。三、动物细胞培养产酶1.动物细胞培养的特点•动物细胞可以产生各种有效高价值的物质•需添加抗生素（常用青霉素和链霉素联合）•细胞生长速度慢•细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感•反应过程成本高（P81），产品价格贵•细胞具有锚地依赖性（宜采用贴壁培养）和接触抑制性•原代细胞一般繁殖50代2.培养方式(1)悬浮培养(2)贴壁培养滚瓶培养微载体培养(microcarrierculture)(3)固定化细胞培养包埋(entrapment)和中空纤维(microencapsulation)培养3.工艺控制⑴工艺流程种质细胞（体细胞；杂交瘤细胞）分散成悬浮细胞细胞悬浮或贴壁培养收集分离纯化产物胰蛋白酶消化⑵培养条件的影响与控制①温度：一般控制在36.5℃.②pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。(需监控和调节，缓冲系统）③渗透压:应与细胞内渗透压相同。④溶解氧：根据情况随时调节。（通过混合气体的量和比列调控）4.产酶实例以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例纤溶酶原纤溶酶纤溶酶原激活剂①种质细胞用胰蛋白酶处理，分散，pH7.4磷酸盐洗涤。稀释成细胞悬浮液②接种到反应器中，与37℃CO2培养箱中，长成致密单层③去培养液，用pH7.4磷酸盐冲洗细胞④换无血清Eagle培养液(P83)，继续培养⑤每3-4天，取出培养液分离纯化⑥再加新鲜Eagle培养液，继续培养⑦亲和层析进行分离+CCC配基蛋白质1.配基固相化2.亲和吸附固体载体3.解吸附细胞生产滚瓶培养装置第三章小结：1.概念：外植体；愈伤组织；微载体培养2.何谓抗体酶？试述获得抗体酶的主要方法。3.论述植物细胞培养产酶的条件控制。4.动物细胞培养的特点有哪些？5.举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。补充：抗体酶一、抗体酶的理论基础1.抗体酶又称催化抗体（Catalyticantibody)是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。2.抗原与抗体：当外源物性物质，如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、颗粒（细菌、细胞、病毒）进入人或动物体内时，机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白（immuneglobin），并以之结合，以消除异物的毒害。此反应称为免疫反应，此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体。IgG与抗原形成的交联晶格3.酶与底物形成过渡态理论酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。二、抗体酶的制备1.诱导法用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，使宿主有机体针对抗原产生抗体，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。将杂交体克隆化，即能产生单一均匀的抗体酶。2、抗体结合位点化学修饰法：抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基因。游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。三、抗体酶的应用1.戒毒:用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。2.肿瘤治疗抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。