中药显微鉴别技术讲义3

第三部分显微制片技术在进行显微鉴别时，首先要将“检样”制成适于镜检的标本。对于完整的药材可制成各种切面的切片；对于粉末药材(包括丸、散等成方)可直接装片或作适当处理后制片。永久片制作技术临时制片技术1、制片设备滑走切片机——半自动切片机脱水机包埋机2变倍体视显微镜是一种具有立体感觉的显微镜。主要用途：作为动物学、植物学、昆虫学、组织学、矿物学、考古学、地质学和皮肤病学等的研究和解剖工具。电脑型连续变倍体视显微镜SZX-16研究用电脑（数码相机）型连续变倍体视显微镜它观察物体时能产生正立的三维空间像，立体感强，成像清晰和宽阔，具有较长的工作距离，，并可根据观察物的特点选用不同的反射和透射光照明，是适用范围非常广泛的常规显微镜。对同一物体可实现连续放大倍率观看,可能直接电视机或电脑上观察实物图像。目镜镜臂物镜转换器物镜玻片移动装置载物台聚光镜光源镜座3、透射光生物学显微镜数码型透射光生物学显微镜123456784、偏光显微镜偏光显微镜偏光显微镜(polarizingmicroscope)用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏振器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中装有另一偏振片（检偏振器，一个偏振方向与起偏振器垂直的起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。在偏光显微镜下，药材的鉴别要素在色彩上表现出一定的变化，可作为大多数植物、动物、矿物类药材的显微鉴别依据之一。如植物的淀粉在偏光显微镜下呈现黑十字现象，不同类型的淀粉其黑十字形象不同（图2）；草酸钙结晶类型多样，在偏光显微镜下呈不同的多彩颜色（图2）；石细胞在植物体内广泛分布，其细胞壁在偏光显微镜下呈亮黄色或亮橙黄色；纤维、导管在偏光显微镜下则呈强弱不同的色彩；动物的骨碎片、肌纤维、结晶状物、毛茸等也呈现出不同的偏光特性；矿物类物质多具有偏光特性。偏光下的草酸钙晶体与淀粉粒5、倒置生物学显微镜6、扫描电子显微镜扫描电镜工作原理扫描电子显微镜（简称扫描电镜）分辨率高，放大倍率5~100,000，能使物质的图像呈现显著的表面立体结构特征，样品制备操作又较简易。在药材鉴定，特别在同科属种间的表面结构的鉴别比较上，已成为一种新的手段。如：扫描电子显微镜用于研究花粉粒、种皮和果皮的表面纹饰，茎、叶表皮组织的结构(毛茸、腺体、气孔、角质层、蜡层、分泌物等)的细微特征，木类药材的解剖以及动物体壁、鳞片及毛等的鉴别。小孢子囊及小孢子微形态差异十三种卷柏大孢子微形态差异使用显微镜的注意事项合理制片，盖玻片上不得有试液残留，避免污染物镜及载物台，损伤镜头。转动物镜转换器，由低到高逐级变换、选用合适放大倍数的物镜观察。使用40倍物镜时，可用细螺旋调节焦距，禁止用粗螺旋调节；也不得移动载玻片。根据观察物象，选择偏光条件确认特征。用毕，应将最小物镜与通光孔相对，关闭光源，罩好，收置起来。显微镜的光学部分，只能用特殊的擦镜头纸擦拭。7、常用制片法——永久片制作技术药材切片标本的制作方法较多。在药材鉴定的研究工作中往往将其制成石蜡切片(永久切片)，因制成的石蜡切片外形较完整，厚薄均匀，且可制得连续切片，观察时方便，又能长期保存。但由于制片技术较复杂，费时太多，不适用于日常检验。常用制片法——临时制片技术徒手切片或滑走切片法：表面装片：为观察叶类、花类及全草类药材的叶片、花冠、萼片、苞片等的表皮组织及其附属物的特征。解离组织装片：可清楚地观察比较坚硬的细胞组织，如导管、纤维、石细胞等的形态。花粉粒与孢子制片法：观察花粉粒、孢子等的形态特征或构造，需用花粉粒与孢子制片法制片。磨片法：观察矿物药或较坚硬的动物类药材如珍珠、石决明及动物骨骼，可采用磨片法制片。7.1仪器和用具仪器生物学显微镜（最好具有2.5×或4×物镜头及偏光装置）、显微摄影装置或显微描绘器、电脑联机装置及其图像处理软件、滑走切片机、小型粉碎机、台式离心机、医用超声仪等。用具放大镜、刀片、镊子、剪刀、解剖针载玻片、盖玻片7.1仪器和用具吸湿器（即玻璃干燥器改装成底部放入蒸馏水加微量苯酚防霉，上部瓷板上置药材样品，利用潮气润湿药材样品）培养皿或小烧杯、酒精灯、试管，试管架、滴管、玻璃棒、乳钵、绸布、滤纸、火柴等。7.2试液——封藏剂7.2.l水合氯醛试液为常用封藏液，也是透化剂。可使干缩的细胞膨胀而透明，并能溶解淀粉粒、树脂、蛋白质、叶绿素及挥发油等，加热后更为明显。7.2.2甘油醋酸试液（斯氏液）为常用封藏液，专用于观察淀粉形态，可使淀粉粒保持原形，便于测量其大小。7.2.3甘油-乙醇溶液封藏液，也是软化剂。常用于保存植物性材料及临时切片，有软化组织的作用。3试液——染色剂7.2.4苏丹Ⅲ试液此液可使木栓化、角质化细胞壁及脂肪油、挥发油、树脂等染成红色或淡红色。7.2.5钌红试液（临用新制）此液可使粘液染成红色。7.2.6间苯三酚试液此液与浓盐酸合用，可使木化细胞壁染成红色或紫红色。7.2.7碘试液（临用现配。应置棕色瓶内保存）此液可使淀粉染成蓝色或紫色；蛋白质或糊粉粒染成棕色或黄棕色。7.2.8硝铬酸试液此液为常用的“植物组织解离液”。各检品的解离浸泡时间，按材料的质地不同而异。7.2.9α-萘酚试液此液可使菊糖染成紫红色，并很快溶解。3.1l氯化锌碘试液此液用于检查木质化与纤维素细胞壁，前者显黄棕色，后者显蓝色或紫色。7.3显微标本的制作7.3.1横切制片或纵切制片7.3.1.1药材的预处理将应观察的部位、切成适当大小的块或段，一般以宽lcm、长3cm为宜，切面削平整。质地软硬适中的样品可直接进行切片；质地坚硬的则需先使其软化后再切片。制片的预处理——软化软化方法可采用放在吸湿器中闷润，或在水中浸软或煮软。经软化处理的材料，检查软化是否合适，可用刀片切割材料，若较容易切下薄片，则表示软化适宜。有些根、根茎、茎及木类药材，质地较坚实，可将削平的切面浸水中片刻，待表面润湿时取出，直接切片也能切成较完整的薄片。过于柔软的样品，可将其浸入70%~95%乙醇中，约20分钟后可变硬些，再切片。制片的预处理——禁忌药材预处理时，应注意不能影响要观察的显微鉴别特征。如要观察菊糖、粘液等在软化、切片、装片等过程中，均不可与水接触，以免溶解消失；要观察挥发油、树脂等，则不可与高浓度乙醇或其它有机溶媒接触。如：茯苓淀粉粒菊糖7.3.1.2切片在检验工作中，此法最常用，操作简便，迅速，制成的切片保持其细胞内含物的固有形态，便于进行各种显微化学反应观察1)徒手切片法切片一手持刀片，另一手拇指和食指夹持样品，中指托着样品的底部，使样品略高出食、拇二指；肘关节应固定，使样品的切面保持水平，刀口向内并使刀刃自前向后切削，即可得薄切片。操作时，材料的切面和刀刃须经常加水或50%乙醇保持湿润，防止切片粘在刀片上。切好的切片用毛笔蘸水轻轻从刀片上推入盛有水或50％乙醇的培养皿中。2)滑走切片机切片此法不需要较高的技巧，只要了解掌握操作方法，短时间内即可学会并切出较薄的切片，适用于切质地坚实、形状较大的药材样品，柔软的样品经冷冻处理亦可切得较薄的切片。切片前：应检查切片机是否稳固，并调试刀具。将切片刀夹持在夹刀器上夹紧，调整刀的角度(约0。~15。)；调整厚度调节器至所需厚度。把制备好的样品用两块软木夹住或直接放在切片机的材料固定器上夹紧夹正，使样品露出软木块或固定器上端0.5cm，调整好样品高度，使刀刃靠近样品的切面且平行并略高于刀刃约0.5~1mm。切片时用右手握夹刀器柄，往操作者方向迅速拉动，切下的切片附着于刀的表面上，用毛笔蘸水把切片取下放于盛水的培养皿中。将刀推回原处，转动厚度推进器，用毛笔蘸水润湿材料切面及刀刃，再拉刀柄，往返推拉，可得到许多厚度均匀完整的切片。若切片不成功，应检查切片刀是否太钝，则应磨刀或换锋锐的切片刀，若切得太薄而破碎，则逐渐增加厚度至能切得完整的薄片为度。注意：夹持在材料固定器上的样品切面接近于固定器上端时，必须注意防止切片刀刃碰撞固定器而损毁切片刀。7.3.1.3装片选取薄而平整的切片置载玻片上，根据所要观察的内容要求，滴加适宜的试液1~2滴，盖好盖玻片，即可在显微镜下观察。为防止较大的切片弯卷，可选取理想的切片，用两张载玻片夹住，浸于水中放置4小时使材料压平，放入95%乙醇中固定，甘油装片观察。透化在载玻片上放有切片处滴加1~2滴水合氯醛试液，置载玻片于酒精灯上方微微加热，至边缘起小泡即停止加热，可继续补充试液再加热，以不烧干为度，直至切片透化完全为止。注意：加热温度不能过高，以防水合氯醛试液沸腾，使组织内带入气泡；加热时应将载玻片不断移动，以免受热不匀而炸裂。透化后放冷，加甘油乙醇试液l~2滴后加封盖片，贴上标签。冬日室温较低时，透化后不待放冷即滴加甘油乙醇液，以防水合氯醛结晶析出而妨碍观察。水合氯醛试液能使已收缩的细胞膨胀，便于清楚地观察组织构造；可溶解淀粉粒、蛋白质、叶绿体、树脂、挥发油等，对草酸钙结晶无作用，为观察草酸钙结晶的良好试剂。如需观察菊糖等一些多糖物质则加水合氯醛试液不加热。7.3.2粉末制片主要用于粉末状的药材及药材粉末制成的成方制剂的观察。4.2.l药材粉末制备取干燥药材，磨或锉成细粉（通常应过80目以上药筛），装瓶，贴上标签。制备粉末时，注意取样的代表性。例如：根类药材要切取根头、根中段及根尾等部位，并全部磨粉，过4号筛，混合均匀，不得丢弃渣头。干燥时，一般温度不能超过60℃，避免淀粉粒糊化，有碍观察。7.2.2粉末制片用解剖针挑取样品粉末少许，置载玻片的中央，加适宜的试液1滴，用针搅匀(如为酸或碱时应用细玻棒代替针)，待液体渗入粉末后，用左手食指与拇指夹持盖玻片的边缘，使其左侧与药液层左侧接触，再用右手持小镊子或解剖针托住盖玻片的右侧，轻轻下放，则液体逐渐扩延充满盖玻片下方。如液体未充满盖玻片，应从空隙相对边缘滴加液体，以防产生气泡；若液体过多，用滤纸片吸去溢出的液体，最后在载玻片的左端贴上标签或书写上标记。7.3.3显微化学分析丁香切片滴加3%氢氧化钠的氯化钠饱和液，油室内有针状丁香酚钠结晶析出；北柴胡横切片加无水乙醇-浓硫酸1：1液，木栓层、栓内层和皮层显黄绿色至蓝绿色。7.3.4微量升华法利用药材所含成分有升华现象，置显微镜下观察结晶形状、色泽。如大黄，可见菱状针状或羽状结晶。7.3.5成方制剂粉末装片按剂型不同，分别处理样品，按粉末制片法装片观察。1)散剂、胶囊剂可直接取出粉末（内容物为颗粒状的应研细）装片，或透化装片。2)片剂可取2~3片，水丸、糊丸、水蜜丸、锭剂等（有包衣者除去包衣）取数丸或1~2锭，置于乳钵中研细，取出适量粉末装片，或透化装片。3)蜜丸剂样品可用两种方法处理：(1)用解剖刀沿蜜丸正中切开，从切面由外至内刮取少许样品，置载玻片中央，滴加适宜的试液，用玻璃棒搅匀。按上述粉末制片法装片，或透化装片。(2)将样品切碎放入容器，加水搅拌洗涤，然后置离心管中离心、沉淀。也可置超声仪中处理少时，以助样品分散。如此反复以除尽蜂蜜后，取沉淀或透化后装片。**含挥发性成分的制剂取其粉末进行微量升华装片。7.3.4粉末制片的注意事项1)粉末药材制片时，每片取用量宜少不宜多，为使观察全面，可多做些制片。如取量多，显微特征单一轮廓不清，反而费时，不易得出准确结论。成方制剂的粉末检查，是在多味药材粉末中寻找某一味药的某一显微特征，有时较难查见，可以取粉末适量，置试管或小烧杯中，加水合氯醛液透化(加适量甘油以防水合氯醛结晶析出)，搅匀，用吸管吸取混悬液装片，观察。2)粉末样品如用水或稀甘油装片时，可先加少量乙醇使其润湿，以避免或减少气泡的形成，或反复将盖玻片沿一侧轻抬，亦可使多数气泡逸出。搅拌时产生的气泡可随时用针将其移出。3)装片用的液体易挥发，装片后应立即观察。用水装片也较易蒸发而干涸，通常滴加少许甘油可延长保存时间。7.3.5表面制片