05版药典微生物限度检查法操作要点

广东省药品检验所05版药典微生物限度检查法操作要点林丽英05版药典微生物限度检查法与以往药典的最大不同就是多了方法验证。由于以前版本的药典没有要求对检验方法进行必要的验证，所以大家都觉得不好理解、不好难操作。为了更好执行05版药典，现根据我的理解，对药典上的各种检验方法在验证时的操作要点与大家作个探讨。一、验证的目的由于制剂在投料和加工过程中，或有抑菌成份存在，或由于各种成份相互作用的结果，将可能对某些类型的微生物的检出产生影响。对所建立的微生物限度检查法进行验证的目的，就是要对每个样品使用适宜的检验方法，顺利的检出样品中污染的各种类型的菌。细菌计数验证所用的菌株：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]：代表革兰阴性菌；金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]：代表革兰阳性球菌；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]：代表革兰阳性杆菌；霉菌计数验证所用的菌株：白色念珠菌[CMCC（F）98001]：代表酵母菌；黑曲霉[CMCC（F）98003：代表霉菌；由于每个菌株代表不同类型的菌，所以只有这五个菌株的回收率均达到要求，才表明样品中污染的各种类型的菌都可能检出来，否则，所得的结果是不能真实地反映样品的污染情况的。菌液的制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～l00cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出胞子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～广东省药品检验所l00cfu的孢子悬液。二、方法的验证所有验证方法的操作均应在阳性接种间。（一）、细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证验证方法取试验可能用的最低稀释级供试液进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌株每次试验的回收率。1．常规法就是取1:10的供试液1ml和50~100个试验菌株加入到1个平皿中，立即倾注相应的琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，培养，计算各菌株的回收率。常规法做一个样品的细菌、霉菌和酵母菌计数验证试验，需要多少个平皿呢？试验组：5×2=10个，即每个菌株做2ml共需10个；菌液组：5×2=10个，即每个菌株的加菌量，每株2个皿。共24个本底菌组：2个细菌计数，2个霉菌和酵母菌计数。细菌计数验证所用的平皿共14个，其中6个用于试验组计数，6个用于菌液组计数，2个用于细菌本底菌计数，倾倒营养琼脂培养基；霉菌和酵母菌计数所用的平皿共10个，其中4个用于试验组计数，4个用于菌液组计数，2个用于霉菌本底菌计数，倾注玫瑰红钠琼脂培养基（虎红琼脂培养基）。回收率=[(试验组菌数-本底菌组菌数)/菌液组菌数]当大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌3个菌株的回收率均达到70%以上时，细菌计数用该验证的方法检验。当白色念珠菌和黑曲霉2个菌株的回收率均达到70%以上时，霉菌计数用该验证的方法检验。2．培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每lml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每lml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为lml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。具体操作：（以1ml分至5个皿为例）广东省药品检验所就是取1:10的供试液1ml均匀分注到5个平皿中，每个皿0.2ml，每株试验菌平行制备2ml的平皿数，然后加入相应的琼脂培养基，培养，计算各菌株的回收率。用该法做一个样品的细菌、霉菌和酵母菌计数验证试验，需要多少个平皿呢？试验组：5×10=50个，即每个菌株做2ml共需50个；菌液组：5×2=10个，即每个菌株的加菌量，每株2个皿。共80个本底菌组：10个细菌计数，10个霉菌和酵母菌计数。3．离心沉淀集菌法取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟(供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心),弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。然后用此稀释液进行检验。4．薄膜过滤法取相当于每张滤膜含1g或lml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或lml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液lml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或真菌琼脂培养上。每种菌株至少制备一张滤膜。即每个验证样品至少制备7个膜。（5个试验组和2个本底菌）（二）控制菌检查方法的验证验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。菌种对试验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(CMCC(B)26003)乙型付伤寒沙门菌(SalmonellaparatyphiB)(CMCC(B)50094)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugmosa)(CMCC(B)10104)生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)(CMCC(B)64941)菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml广东省药品检验所含菌数为10~l00cfu的菌悬液。验证方法（1）试验组取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。（2）阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。三、检验方法（一）计数法的检验计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。1．平皿法常规法和培养基稀释法都是平皿法。供试液通过离心沉淀以后也可用平皿法检查。采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。取供试液lml，置直径90mm的无菌平皿中（培养基稀释法，则将1ml供试液均匀分注入2个或以上的平皿中），注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。阴性对照试验取试验用的稀释液lml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。培养和计数除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48广东省药品检验所小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落汁数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点汁霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。(1)当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。(2)当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值(比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值)而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。(3)当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。(4)如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。2．薄膜过滤法采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为50mm。选择滤膜材质广东省药品检验所时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。取相当于每张滤膜含1g或lml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或lml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液lml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。阴性对照试验取试验用的稀释液lml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。菌数报告规则以相当于1g或lml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1ml供试品)，或1乘以最低稀释倍数的值报告（二）控制菌检查法供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。阳性对照试验供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为l0～l00cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验取稀释液10m1照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。控制菌检查采用培养基稀释法时，可加大增菌培养基的用量。广东省药品检验所基本程序：供试液制备增菌培养选择性培养基培养挑取疑似菌落生化试验报