仲伟鉴-保健食品毒理及功能检验与评价1014

保健食品毒理和功能检验及评价仲伟鉴上海市疾病预防控制中心2010.10主要内容提纲中国保健食品简介保健食品安全性毒理学检验与评价保健食品新原料安全性毒理学评价原则保健食品安全性毒理学评价中存在的问题保健食品功能性检验与评价保健食品功能评价方法更改情况第一部分中国保健食品简介第二部分保健食品安全性毒理学检验及评价主要内容检验评价依据审评基本要求选择毒理学试验的基本原则实验动物的选择样品的预处理原则毒理学试验项目要点介绍毒理学安全性评价时应考虑的问题审评结论的判定毒性及功能检验评价依据1996年3月卫生部《保健食品的管理方法》保健食品的标准、功能评价、审批程序和监督管理办法1996年7月GB15193《食品安全性毒理学评价程序和方法》卫生部《保健食品功能学评价程序和检验方法》仅包含了12项功能检验及评价方法2001年7月卫生部《保健食品功能学评价程序和检验方法》可受理和评价的功能调整到31项2003年2月卫生部《保健食品检验与评价技术规范》将功能学、毒理学、功效成分及卫生指标检验评价方法三者合一审评的基本要求1.配方原（辅）料、用量、理化性质2.剂量食用方法及用量3.工艺规格化产品符合配方、工艺、质量标准4.批号注意批号是否一致,益生菌、奶制品等保质期短的除外1.毒理学评价的四个阶段第一阶段：急性毒性试验经口急性毒性试验：LD50，联合急性毒性，一次最大耐受量试验第二阶段：遗传毒性试验，30天喂养试验，传统致畸试验遗传毒性试验：原核细胞和真核细胞，体内试验和体外试验相结合Ames或基因突变试验；微核试验或染色体畸变试验；精子畸变试验等第三阶段：亚慢性毒性试验90天喂养试验、繁殖试验、代谢试验第四阶段：慢性毒性试验（包括致癌试验）选择毒理学试验的基本原则2.无需进行毒性试验的保健食品以普通食品和卫生部规定的药食同源物质为原料生产的；1）以传统工艺生产且食用方式与传统方式相同的2）以水提物配制生产、服用量为原料常规用量，且资料未提示具有不安全性用已列入营养强化剂或营养素补充剂名单的营养素化合物为原料的，如其原料来源、生产工艺和产品质量均符合国家有关要求；选择毒理学试验的基本原则3.需进行一阶段和三项致突变毒性试验的保健食品属于普通食品和卫生部规定的药食同源的物质且用水提以外的其它常用工艺生产的：（1）服用量与常规用量相同急性毒性、三项致突变试验（2）服用量大于常规用量还需加做30天喂养试验，必要时进行传统致畸试验和第三阶段毒性试验选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则4.需进行一、二阶段毒性试验的保健食品以普通食品和卫生部规定的药食同源物质以及允许用作保健食品的物质以外的动植物或动植物提取物、微生物、化学合成物等为原料生产的保健食品，原则上须进行第一、二阶段的毒性试验，必要时进行下一阶段的毒性试验。卫生部规定允许使用的动植物及其提取物或微生物为原料的。5.需进行一至三阶段毒性试验的情况：一、二阶段试验结果与国外产品不一致的国外少数国家或地区食用的原料或成分水提取物，大于常规服用量用水提以外的其它常用工艺生产的，大于常规用量选择毒理学试验的基本原则6.需进行一至四阶段毒性试验的原料和成分国内外均无食用先例7.敏感指标及敏感试验的保健食品不同食用人群和（或）不同功能的保健食品选择毒理学试验的基本原则对受试保健食品的要求单一已知化学成分，应提供物理和化学性质多种原料的配方产品，应提供配方配方产品，必要时还应提供各组分，功效成分的物理和化学性质及其检测报告提供原料来源、生产工艺、人的可能摄入量。使用说明书等有关资料受试物应符合既定配方和生产工艺的规格化产品实验动物的选择及给样量1.根据各项实验的具体要求，合理选择实验动物常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系。2.动物应符合《实验动物管理条例》清洁级或清洁级以上动物合格证号及动物实验室合格证号3.灌胃量大鼠：10ml/kg•BW（若以水为溶剂，推荐20ml/kg•BW）小鼠：20ml/kg•BW样品的预处理原则1.介质的选择应选择适合于受试动物的溶剂、乳化剂、助悬剂，要求无毒、与受试物不发生反应、稳定性好。常用的介质有：蒸馏水、食用植物油、淀粉、明胶及羧甲基纤维素等。2.液体类受试物浓缩倍数应符合试验要求。浓缩方法不应破坏其有效成份，常用的有60℃～70℃减压或常压蒸发、冷冻干燥。按工艺要求。样品的预处理原则3.袋泡茶类处理方法与产品推荐饮用方法相同推荐用：80℃--90℃常压用水浸泡30min水量为受试物的10倍，提取2次，2次提取液合并浓缩至所需浓度标明该浓缩液与受试物的比例样品的预处理原则4.含乙醇类（1）不需浓缩的受试物乙醇浓度15％直接进行试验乙醇浓度15％乙醇浓度应调至15％（2）需浓缩的受试物乙醇浓度15％浓缩后调至原乙醇浓度乙醇浓度15％浓缩后调至15％乙醇浓度在进行乙醇浓度调整时必须用原酒基样品的预处理原则5.膨胀系数较高的受试物选择可溶性介质给受试物的方法：灌胃其最高浓度最大灌胃量时达不到人体推荐量的100倍，按采用实际达到的倍数标明受试物的膨胀系数样品的预处理原则6.益生菌等微生物类保健食品在进行Ames试验或体外细胞试验时需将受试物灭活。需浓缩的应采用低温干燥法或由企业提供所需浓度的受试物（附方法、技术参数）。7.以食品为载体的受试物（1）有营养价值：按设计量进行饲料的营养成份调整，提供详细的说明。（2）大豆蛋白、乳清蛋白如质量、工艺等符合食品标准和安全要求，允许去除。如仅以该原料生产的，可申请免做毒理学试验。毒理学试验项目要点介绍急性经口毒性试验鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验骨髓细胞微核试验哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验小鼠精子畸形试验小鼠睾丸染色体畸变试验30天喂养试验急性经口毒性试验目的：测定LD50，毒性分级。了解毒性强度、性质和可能的靶器官，为进一步的毒性试验提供剂量和观察指标的选择依据。原理：急性毒性：经口一次性、24h内多次给予，短时间内的毒性反应。致死剂量通常用半数致死剂量LD50表示。急性联合毒性：两种或两种以上的受试物，可能发生拮抗、相加或协同的联合方式，可以根据一定的公式计算和判定标准来确定这三种不同的作用。急性经口毒性试验时间周期：一般为3周3-5天，大、小鼠适应期7-14天，染毒及实验观察期发生动物死亡时，应进行大体解剖观察和评价指标：毒性反应症状：各器官系统的异常表现（中枢、自主神经、呼吸、心血管、胃肠、生殖泌尿系统、皮毛、粘膜等）及体重变化死亡情况：死亡的时间、数量、性别、表现等。大体尸检结果：如果发生死亡动物急性毒性（LD50）剂量分级表级别大鼠口服LD50，mg/kg相当于人的致死量mg/kgg/人极毒1稍尝0.05剧毒1-50500-40000.5中等毒51-5004000-300005低毒501-500030000-25000050实际无毒5001-15000250000-500000500无毒150005000002500急性经口毒性试验试验结果的判定：1.LD50＜人可能摄入量的100倍，放弃；反之继续下一步试验。2.LD50≥10g/kgbw或按最大耐受量染毒而未出现动物死亡的，可继续下一步试验。鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验目的：检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。时间周期：一般为2周第一周，鼠伤寒沙门氏菌种、试剂、培养基准备第二周，染毒，培养48h，菌落计数剂量设计：决定受试物最高剂量的因素是对细菌的毒性及其溶解度。最低剂量为0.2ug/皿；最高剂量为5mg/皿，或最大溶解剂量，最大饱和剂量以及最小毒性剂量。可设五个剂量组，组间距不超过5倍。同时设：阳性对照组，溶剂对照组和未处理对照组。鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验观察及评价指标：各受试物组及三个对照组的四种菌株（TA97a，TA98，TA100和TA102）分别在加和不加S9情况下的菌落计数。结果评价（掺入法）：受试物组回变菌落数增加一倍以上（即回变菌落数≥2×未处理对照组数），并有剂量反应关系或有可重复的阳性反应，即可判试验阳性。骨髓细胞微核试验目的：检测整体动物体内骨髓嗜多染红细胞微核发生率，以评价受试物致突变的可能性。原理：微核是在细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的色单体或染色体的无着丝点断片。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞胞质内，因比主核小，故称为微核。骨髓细胞微核试验时间周期：一般为2周3-5天适应期小鼠经口染毒，30h给受试物法取胸骨或股骨，收集骨髓，涂片，染色，镜检剂量设计：至少设置3个剂量，最高剂量组为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量。低剂量组应不出现毒性反应。一般取LD50的1/2、1/4、1/8作为三个剂量。当受试物的LD50≥10g/kg.bw时，最高剂量通常采用10g/kg.bw。同时设阳性对照组和溶剂对照组。骨髓细胞微核试验观察及评价指标：每只动物计数1000个嗜多染红细胞，记录含有微核的细胞数，并计算微核千分率。同时观察嗜多染红细胞与成熟红细胞的比例。结果评价：受试物组与对照组微核率相比，增高呈剂量反应关系并有统计学意义，试验结果为阳性。哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验目的：检测受试物对整体动物骨髓细胞染色体畸变的致突变性，以评价其致突变的可能性。原理：当受试物作用于细胞周期G1期和S期时，可诱发染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色体单体型畸变。给动物腹腔注射秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩短、分散，轮廓清晰。在显微镜下便可观察染色体数目和形态。哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验时间周期：一般为3周3-5天适应期小鼠或大鼠经口染毒2-4次，每次间隔24h，在末次染毒18-24h进行取材（取材前2-4h，腹腔注射秋水仙素）。取股骨，收集骨髓，制片，染色，镜检剂量设计：同骨髓细胞微核试验哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验观察及评价指标：每只动物分析100个中期相细胞，每个剂量组不少于1000个。记录染色体数目及结构的改变。结果评价：受试物组与对照组染色体畸变率相比，增高呈剂量反应关系并有统计学意义，试验结果为阳性。小鼠精子畸形试验目的：检测整体动物体内精子畸形发生率，以评价受试物对体内生殖细胞的致突变作用。原理：小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因决定精子形态。精子的畸形主要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白产物的改变。小鼠精子畸形试验时间周期：一般为7周3-5天适应期小鼠经口连续染毒5天，于首次给样后的35天处死动物取两侧附睾，收集精子，滴片，染色，镜检剂量设计：同骨髓细胞微核试验小鼠精子畸形试验观察及评价指标：每只动物检查1000个精子，记录精子畸形数目及类型。结果评价：受试物组与对照组精子畸变率相比，增高呈剂量反应关系并有统计学意义，试验结果为阳性。小鼠睾丸染色体畸变试验目的：检测整体动物睾丸染色体畸变发生率，以评价受试物对整体哺乳动物睾丸生殖细胞的致突变性。原理：不同周期的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性不同，多数情况下化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复制期，故在前细线期处理。第12～14d采样，以观察作用于前细线期引起的精母细胞染色体畸变效应。小鼠睾丸染色体畸变试验时间周期：一般为7周3-5天适应期小鼠经口连续染毒5天，与首次给样后的12-14天处死动物取材，（取材前6h，腹腔注射秋水仙素）。取两侧睾丸，收集生殖细胞，滴片，染色，镜检剂量设计：同骨髓细胞微核试验小鼠睾丸染色体畸变试验观察及评价指标：每只动物分析100个中期相细胞，记录染色体数目及结构的改变（包括断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等）。结果评价：受试物组与对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等差异有统计学意义，试验结果为阳性。遗传毒性试验组合试验结果的判定：如三项致突变试验