双水相萃取

5.2双水相萃取1双水相萃取双水相系统：因两种水溶性（聚合）物的水溶液，或一种水溶性聚合物水溶液与盐溶液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统特点：•两相均含有大量的水（高达80%以上），•界面张力小，一般只有0.5-10-4mN/m，•萃取环境和条件温和，•生物相容性好，有时有稳定作用；•分配系数可控：聚合物修饰、相系统组成、操作条件容易放大。2发展历史•1896年荷兰微生物学家Berjerinck发现琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合时形成双水相现象。•1956年瑞典lund大学的Albertsson教授及其同事开始对双水相系统进行比较系统研究。测定了许多双水相系统的相图，考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在双水相中的分配行为，为双水相萃取系统的发展奠定了基础。只局限于实验室内的测定和理论研究。3发展历史•Kula教授研究小组对双水相的应用、工艺流程、操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研究，在应用上获得成功。1978年首先将双水相萃取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工业装置，达到20kg/h的处理能力，分离纯化了几十种酶，也应用于基因工程产品的分离。•双水相萃取可分离多肽、蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织，以及重金属离子等，近年来，还应用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。作为反应系统用于酶反应，生物转化，发酵的产物生产与分离的集成。4缺点和不足•双水相系统含较高浓度的水溶性聚合物和盐，会带到产物中，去除需要辅助处理方法。•成本较高。即使水溶性聚合物和盐尽管回收再用。•选择性较低，分离纯化倍数低，一般只适用于粗分离。5研究最多的几种典型双水相系统A聚丙二醇(PPG)聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚蔗糖(Ficoll)羟丙基葡聚糖聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚乙烯吡咯烷酮B硫酸葡聚糖酸钠羧甲基葡聚糖酸钠聚丙烯乙二醇甲基纤维素C羧甲基葡聚糖酸钠羧甲基纤维素钠盐D聚乙二醇硫酸钾，硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁，磷酸盐酒石酸钠琥珀酸钠，柠檬酸纳E聚乙二醇葡聚糖乙二醇单丁酯丙醇A,两者均为非离子性聚合物,B,一种非离子性聚合物，另一种为带电荷的聚电解质C,两者均为聚电解质,D,一种聚合物，另一种为盐。E,一种聚合物，另一种为有机小分子6双水相系统双水相系统及成相机理•两种水溶性聚合物溶液混合，形成单一相还是两相，主要取决于两种因素：系统熵的增加；分子间的作用力。•熵的增加与分子数目有关，与分子大小无关；而分子之间的相互作用力可看作分子中各基团相互作用力之和，随分子量的增加而增加。•分子量大的聚合物以摩尔计的相互作用能超过混合熵的增加而起主导作用，进而决定聚合物溶液混合发生的现象。•当两种聚合物之间互不相容，而排斥，它们的线团结构无法互相渗透，导致同种分子互相包围，在达到平衡后，形成了互不相容的各自富含单一种聚合物的两相。7双水相系统及成相机理•Zaslavsky等人认为，聚合物引起水溶液结构变化是促进相分离的主要原因。X-射线衍射数据表明，无水时葡聚糖（DEX）与聚乙烯醇(PVA)混合物(1:1)并不表现不相溶性。在水溶液中，即使在低浓度（3.5%DEX和2.45%PVA）下也会发生相分离。在水溶液中，聚合物的长链分子通过氢键同周围的水分子发生强烈地相互作用，每一个氧原子结合两个水分子，使溶液中的高分子被一层高度有序的水合作用层所包围。例如，葡聚糖虽无与PEG类似的结构，但同样，分子中的羟基通过氢键作用在分子周围形成水分子层。8双水相系统及成相机理•两种聚合物周围形成不同的互不相容的分子结构造成相分离。这一机理可解释温度、添加无机盐和尿素等对相分离行为的影响。•按聚合物对溶剂水性质的影响程度为PEG＞PVA＞PVP＞Ficoll（聚蔗糖）＞DEX，而成相所需聚合物浓度为DEX-PVA＜DEX-PEG＜DEX-PVP＜DEX-Ficoll。综合考虑聚合物的分子量因素，二者的次序十分一致。•某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合，两者浓度达到一定值时，也会分为两相，形成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一种解释为‘盐析’作用。9双水相系统及成相机理•无机盐和简单的有机盐均可，其成相（相对）能力与其盐析能力次序基本一致。•阴离子作用比阳离子重要。•多原子离子比单原子离子更有效，成相浓度低。•大而电荷密度低的单原子阴离子容易与PEG分子中的氧偶极子发生作用，成相浓度高，无法使用。但它们可以作为中性盐添加组分加入聚合物/聚合物和聚合物/盐系统中，用于改变分配系数。•对于聚合物/盐系统，因盐比葡聚糖便宜得多，使得聚乙二醇(PEG)/盐系统具有工业上应用优势。10选择双水相的原则•能够获得高的产物回收和生物活性回收，高的分离纯化倍数；•系统的物理化学性质有利于大规模的应用，有良好的工艺性能，系统黏度低，相分离快，达到相平衡时间短，工艺参数容易控制，工艺条件可调性范围大；•系统经济，成本低，无毒，适合大规模应用。11双水相系统相图PEG(%)葡聚糖（%）图1PEG/葡聚糖系统相图12双水相系统相图PEG(%)盐（%）图2PEG/盐系统相图13成相及上、下相组成•相图中TCB联线为一双节点线，双节点线下方为单相区；双节点线上方为两相区。如果系统组成处于该区，如M点时，系统分为两相，而上相和下相的组成分别为通过M点与双节点线相交的T和B点相对应的组成。上相主要含有PEG，下相主要含有葡聚糖或盐。两相平衡时，符合杠杆规则。当用υT代表上相体积，υB代表下相体积时，则•式中BM为B点到M点的距离，MT为M点到T点的距离。M点向下移动时，系线长度缩短，两相差别减少，到达C点时，系线长度为0，两相间的差别消失而成为一相。因此，C点成为系统的临界点。MTBMBT14PEG(%)葡聚糖（%）图3PEG/葡聚糖系统的双节点线形状和临界点与聚合物分子量的关系PEG6000，葡聚糖分子量：1:D5(Mn=2800)2:D17(Mn=23000)3:D24(Mn=40500)4:D37(Mn=88000)5:D43(Mn=180000)6:D67(Mn=630000)相图的双节点线的位置和形状与相系统组成及相系统组分的物理化学性质有关，如聚合物的分子量和分子形状。在PEG/葡聚糖系统，如果PEG分子量不变，增加葡聚糖的分子量，相分离所需的葡聚糖浓度越低；两种聚合物分子量相差越大，双节点线的形状越不对称。在PEG/盐系统中，PEG分子量越大，双节点线也越陡立。15分配系数一种物质在两相系统中的分配行为可用分配系数来描述，分配系数K为该物质在上相和下相中的浓度之比。此处cT和cB分别为上相和下相中的目的物质浓度。当目的物质主要分配在上相时，分配系数K值大于1，并随在上相中浓度的增加而增加；反之，目的物质主要分配在下相时，分配系数K值会小于1，并随在下相浓度的增加而减小。控制能够影响物质分配系数K的因素，包括环境因素，相系统性质和组成就可以改变物质的分配系数。BTccK16双水相系统的分类按照物质在双水相系统的分配作用类型，可分为空间排阻分配、电化学分配、构型相关性分配、亲和分配、疏水分配和手性分配等类型。分配类型典型相系统影响因素主要可调因素相系统因素溶质性质空间排阻分配PEG/EDX聚合物分子大小表面积聚合物分子量、浓度电化学分配PEG/盐相界面静电位表面电荷pH、盐种类、聚合物电荷性质构型相关性分配聚合物分子空间构型空间构型聚合物分子量、浓度、pH、温度亲和分配染料-PEG/DEX配基亲和性能特异的亲和位点配基种类、浓度、pH疏水分配烷基-PEG/DEX相间疏水性差异表面疏水性聚合物分子量、浓度、疏水性改性手性分配手性配基-PEG/DEX聚合物光学活性光学活性聚合物的光学活性17普通双水相系统普通双水相萃取是指主要依靠空间位阻分配和界面电位分配的双水相萃取，如利用聚合物/聚合物系统和聚合物/盐系统的萃取，它们发展最早，也是研究最多和应用最多的双水相系统，也是其它分配萃取系统的基础。为了改进萃取效率和分离效果，利用控制相系统的pH或在相系统中加入盐或有机溶剂的方法提高目的物的分配系数。普通的双水相萃取系统的选择性比较低，只适用于产物回收和初步分离。18功能团配基亲和萃取将对目的酶具有离子交换、疏水作用或适当亲和力的亲和配基结合在构成双水相系统的某一水溶性聚合物上，与另一水溶性聚合物构成双水相系统。根据使用基团的性质，可分为：离子分配萃取疏水萃取亲和萃取：免疫配基亲和萃取，染料配基亲和萃取和金属螯合亲和萃取等。手性分配萃取利用对目的酶的专一性结合能力，将其萃取到目的相中，并通过控制其他条件，将杂质分配到另一相中，达到分离目的。19离子分配萃取利用共价键将离子交换基团如-NH2，-COOH，-PO43-，-SO42-结合在成相水溶性聚合物上，构成双水相系统，与酶蛋白分子的相互作用进行分配的双水相萃取，其分配行为在很大程度上与蛋白质的表面电荷性质有关，也受到系统的各种因素，如pH、盐浓度和种类、温度等条件的影响。由于这一类功能团配基与酶的相互作用的选择性并不很高，萃取效率和纯化倍数虽然比一般双水相萃取系统高，但低于其他亲和萃取系统。例如利用PEG-磷酸酯/磷酸盐系统进行β-干扰素的提取，分配系数可达到630，杂蛋白几乎完全分配在下相。20疏水分配萃取利用共价键将疏水基团，如烷基或芳香基结合在水溶性聚合物上，构成的双水相萃取系统。通过疏水基团与蛋白质表面的疏水区域的相互作用，将蛋白质萃取在富含疏水配基的相中，达到分离的目的。由长链脂肪酸与PEG形成的PEG脂肪酸酯作为功能团配基与PEG混合与其他成相组分构成双水相系统，通过与酶蛋白的疏水作用达到分离目的。由于盐浓度对疏水作用影响很小，疏水分配萃取可以用于高盐浓度的物料的分离。21金属螯合亲和萃取•将适当的螯合试剂通过共价键结合在PEG上，与适当的金属离子螯合，再与PEG/聚合物双水相系统构成金属螯合亲和萃取系统。•如卤代烷氧基-PEG与亚氨二乙酸(IDA)在碱性条件下反应，生成IDA-PEG，每一个IDA-PEG分子螯合一个金属离子，如Cu2+，Zn2+，Ni2+或Co2+等，与适当的PEG/聚合物双水相系统构成金属螯合亲和萃取系统。•这里螯合的金属离子的配位键未满足，仍然可以和蛋白质分子表面的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸的N、O或S形成配位键，将酶蛋白结合在螯合基团上。22因此，目的酶被萃取在PEG相中。萃取的选择性主要取决于螯合基团、金属离子和蛋白质表面的氨基酸残基。这种结合作用不受高盐浓度的影响，可构成PEG／盐系统。金属离子-蛋白质复合物可在pH4～５范围解离，将酶释放；也可以加入具有金属螯合作用的物质如EDTA等将目的酶替换出来。该方法对于那些金属离子容易引起变性的酶和以金属离子为辅酶，或以金属离子为维持高级结构所必须的酶的实用性有一定问题，可能引起酶变性或失活。23染料亲和萃取酶作用的底物、产物、抑制剂、辅酶等虽然可作为亲和配基使用，但因与PEG的共价键结合比较困难，结合的配基活性较低，使应用有难度。染料亲和萃取是指以活性染料为亲和配基的双水相萃取系统。因染料的亲疏水性，稳定性，亲和常数大小，来源，价格，以及与水溶性聚合物结合的难易，对酶活性的影响等因素，使得可用作配基的染料不多，24在双水相亲和萃取系统中研究和应用最多的是活性染料配基，如Procion和Cibacron系列。由于它们具有适宜的立体结构和亲疏水性，在碱性条件下容易共价结合在PEG、葡聚糖等水溶性聚合物上，并且与许多酶具有亲和能力而被广泛使用。25利用染料亲和萃取分离的酶和蛋白质酶类酶或蛋白质脱氢酶乙醇脱氢酶，甲醛脱氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，古氨酸脱氢酶，甘油-酸脱氢酶，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶激酶甘油激酶，己糖激酶，3-磷酸甘油酸激酶，磷酸果糖激酶，丙酮酸激酶转氨酶谷氨酸-草酰乙酸转氨酶，谷氨酸-丙酮酸转氨酶其他烯醇酶，磷酸甘油酸异构酶，硝酸还原酶，糖苷酶，白蛋白，白蛋白前体，γ-球蛋白等利用以PEG-CibacronBlueF3