14内药物分析法

第七章内药物分析法药物的体内过程：研究生物体中药物代谢及其代谢物和内源性物质的质和量变化规律的分析方法学。给药吸收分布代谢排泄第一节体内样品种类体内样品：各种体液和组织。主要包括血液、尿液、唾液。最为常用的样本是血液。采集时间：根据临床治疗药物监测的不同目的确定。目的取样时间确定、调整用药方案用药稳态后临床治疗药物检测用药稳态后急性药物中毒诊断用药后立即药动学、药效学给药前、给药后多时间点一.血样（全血-Wholeblood,血浆-Plasma,血清-Serum）1.血样采集：患者（静脉），动物实验（动脉、心脏）。2.全血采集：采集后放置于含抗凝剂（肝素、乙二胺四乙酸EDTA、草酸盐、枸缘酸盐）的试管中，混合均匀即得。3.血浆的制备：全血→抗凝剂试管→混合→1000xg力离心5~100min→上清液即为血浆。4.血清的制备：全血→室温放置0.5~1h→凝固出现血饼→600xg力离心5～10min→上清液即为血清。5.注意事项血样采集后应及时分离血浆和血清，最好立即分析。全血：血液于抗凝管中，冷冻储存或直接分析。短期4℃，长期-20或-80℃保存。二.尿样1.尿液测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、预测药物的代谢过程和代谢类型。2.尿药浓度改变不直接反映血药浓度，受试者肾功能将影响药物的排泄，所以尿液样品的采集和测定应当与肾功能指标进行关联分析。3.尿液的分类：随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿、时间尿。4.尿液的采集（自然排尿）：测定尿液中药物浓度时应采用时间尿。测定尿液中药物的总量时，应收集用药后一定时间内的全部尿液，进行分析。5.尿液的处理方法：处理：采集后应立即测定。保存：低温保存，或加入防腐剂（盐酸、二甲苯、三氯甲烷等）。三.唾液1.唾液：腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔黏膜腺体分泌的黏液在口腔里混合而成的消化液。2.采集：安静状态，漱口后15min进行，采集时间为10min，采用一些物理或化学方法刺激唾液分泌。3.保存与处理：取样后，除去泡沫，用1000xg力离心10min，取上清液，冻存或直接分析。唾液采集后在4℃下保存，往往需要在取样时测定pH值。第二节体内样品处理目的：不破坏测定成分的前提下，用适当的方法分离纯化或浓缩待测药物，以减少干扰、提高检测灵敏度和特异性、降低对仪器的污染和损害。常用方法：①去除蛋白质法②缀合物水解法③分离纯化与浓集法④化学衍生化法影响因素：样品种类、被测药物的性质、浓度、测定方法的选择。①样品种类：如血浆或血清需要清除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；尿液样品则常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出；唾液样品主要采用离心去除黏蛋白沉淀。②测定方法：测定方法的耐受污染程度和抗干扰能力越强、专属性越好、灵敏度越高，则对前处理的要求越低。一.去除蛋白法：蛋白沉淀法和蛋白分解法1.蛋白沉淀法：加入有机溶剂、强酸和无机盐①加入与水混溶的有机溶剂原理:水溶性的有机溶剂可使蛋白质分子内及分子间的氢键变化，使蛋白质凝聚，进而使与之结合的药物释放。常用有机溶剂:乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃体积比：1：1～3,90％去除方法：超速离心（10000r/min）实例:乙腈沉淀蛋白质为絮状，易于离心去除；甲醇沉淀蛋白则为细小颗粒状，需高速离心去除。使用乙腈或甲醇时上清液pH为8.5~9.5，使用丙酮时上清液pH为9~10。②加入强酸原理：当溶液pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，可与酸根阴离子形成不溶性盐而沉淀。常用强酸：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液、5％偏磷酸体积比：1：0.4，90％去除所得上清液呈强酸性（pH0~4）。③加入无机盐原理：加入无机盐后，溶液的离子强度发生变化，抑制蛋白质解离，无机盐具有比蛋白质更强的亲水性和电解能力，使蛋白质盐析脱水而沉淀。常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐比例：1：2混合，90％去除方法：超速离心（10000r/min）所得上清液近中性，pH为7.0~7.7。2.蛋白分解法①原理：在测定某些与蛋白结合牢固、且对酸不稳定的药物时，常需用酶解法使蛋白分解而释放出药物。②枯草菌溶素不仅可使组织酶解，且可使药物析出。③应用：主要用于脏器组织中药物的测定。二.缀合物水解法：酸水解法和酶水解法1.酸水解法：使用无机酸如盐酸、磷酸特点：简单、快速、专属性差2.酶水解法：常用葡萄糖酸酐酶或硫酸酯酶，或者二者的混合物用时应按不同酶的要求控制条件、PH值在4.5-7.0，37℃培育数十小时，进行水解。如果尿液在采用酶水解，应先除去尿中能抵制酶的阳离子。特点：高选择性，专属性强，低降解性，酶水解比酸水解温和，一般不会引起被测物分解，缺点：水解时间稍长，费用大，酶制剂可能引进粘液蛋白，易引起乳化或色谱柱阻塞。应用范围：遇酸及受热不稳定的药物三.分离纯化与浓集法：萃取法1.液-液提取法（LLE）①关键要考虑三个方面的因素：有机溶剂的特性有机溶剂相和水相的体积水相的pH值②优点：简单，选择性好，去除内源性物质干扰能力强，应用广泛。2.固相萃取（SPE）①原理：将具有吸附、分配或离子交换性质的大比表面积吸附填料作为萃取剂填成小柱，柱色谱分离方法。②决定因素：药物与固定相表面的活性基团、药物与溶剂分子间的分子间作用力。③优点：引入的杂质少；可以完全避免乳化的形成；有较高的萃取回收率，重现性好；小柱可弃，没有污染；需要的样品量少；洗脱溶剂多为水溶性的，易于实现自动。④缺点：价格昂贵，技术要求高，小柱各批之间有差异，柱子容易堵塞，影响分离效果。四.化学衍生化法1.目的：改变待测药物的色谱行为；增强药物的稳定性；改善（手性拆分）分离能力；提高检测灵敏度。2.GC法——硅烷化法（应用最广）①硅烷化：与葡萄糖醛酸结合的药物②烷基化：有活性氢原子的药物③酰化：具有-NH2、-OH的药物3.HPLC法——柱前衍生化法、柱后衍生化法①柱前衍生化法：分离前使药物与衍生化试剂发生反应。②柱后衍生化法：药物经色谱分离后在流出液中进行衍生化。一般用紫外检测器第三节体内样品的测定一.体内样品测定的常用方法免疫分析法:色谱分析法:测定方法免疫分析法色谱分析法灵敏度+++++++专属性+++++适用范围临床治疗药物监测药代动力学研究1.免疫分析法(Immunoassay，IA)①原理：特异性抗原-抗体反应为基础②应用：测定生物利用度和药物代谢动力学参数等重要数据。监测药物血液浓度。快速测定有效组分的含量。对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。2.色谱分析法：GC/HPLC/GC-MS二.定量分析方法验证1.体内样品定量分析方法验证的指标：特异性标准曲线与线性范围定量下限精密度与准确度样品稳定性提取回收率质控样品与质量控制2.特异性①定义：必须证明所测定的物质是原型药物或者特定活性代谢物。②要求：6个不同来源的空白体内样品色谱图、空白体内样品外加标准物质色谱图以及用药后的体内样品色谱图。3.标准曲线（standardcurve）①定义：生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度）②要求：至少6个浓度建立标准曲线应使用与待测样品相同的生物介质通常用线性回归方程来评价4.线性范围（linearrang）①定义：标准曲线的最高与最低浓度的区间②要求：至少含6个浓度点(不包括空白点)可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度偏差%＝[（回归值－标示值）／标示值]×100%5.定量下限①定义：标准曲线上的最低浓度点②要求：S/N应大于5满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度是Cmax的10％～5％至少5个标准样品测试结果证明。6.精密度与准确度①样品选择：3个浓度，低浓度为定量下限3倍以内，高浓度接近标准曲线的上限附近，中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品。②精密度：批内、批间精密度。RSD＜15%，最低定量限附近＜20%。③准确度：相对回收率表示。在85~115%，最低定量限附近在80~120%。7.样品稳定性①定义：一种分析物在确定条件下，一定时间内在一定介质中的化学稳定性。②要求：对含药生物样品再室温、冷冻或冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察。8.提取回收率①定义：反映出样品预处理过程中组分丢失的情况，是评价萃取方案优劣的指标之一，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。②要求：考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其值一般低于100%（可能低至60%），但重要的是重现性好。9.质控样品：将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质量控制。10.质量控制：每个分析批均应建立相应标准曲线，并随行测定高、中、低3个浓度的质控样品。要求：6个QC样品中至少4个的测定结果的准确度在各自正常浓度80％～120％，RSD≤20%，允许由2个QC样品超出各自的±20％。三.应用1.治疗药物监测（TherapeuticDrugMonitoring,TDM）监测对象：治疗安全浓度范围窄、治疗剂量与中毒剂量相近、毒副作用强、具有非线性药代动力学特征、长期使用药效和毒性不明确、以及联合用药可能发生相互作用的药物。2.在药代动力学研究中的应用例如：地高辛的药代动力学研究，以毛地黄毒苷为内标，用LC-MS测定人血浆和尿液中地高辛浓度。本章小结1.体内样品种类：血样、尿样和唾液的采集和处理方法。2.体内样品处理的常用方法：去除蛋白质法、缀合物水解法、萃取分离法、化学衍生化法的基本原理、优缺点和应用范围。3.体内样品测定：常用方法的基本原理、验证指标以应用。习题1.TDM的意思是指（）A、临床监护B、种药物代谢酶C、相对标准差D、治疗药物监2.从机体采集的血液加抗凝剂经离心后得到的上层清液称为（）A、血浆B、血清C、血球D、血样3.血样的长期冷冻贮存是指（）A、4～8℃B、-20℃以下C、-18℃以下D、0～4℃4.表示生物介质中药物最低可测浓度的是（）A、线性范围B、定量下限C、检测限D、可信限5.尿样的采集一般为（）A、服药后8hB、服药后2～12hC、服药后24hD、服药后一定时间内总量