第12章 免疫学技术与方法

1第十二章免疫学技术与方法2指利用抗原抗体反应的特异性原理，建立各种检测与分析技术以及建立这些技术的制备方法。分为：免疫检测技术（血清学技术）细胞免疫技术免疫制备技术免疫学技术3血清学技术的类型（免疫检测技术）凝集反应沉淀反应补体结合反应免疫标记技术4•指与细胞免疫有关的各种检测技术，包括对免疫细胞、细胞因子的检测及功能分析。细胞免疫技术淋巴细胞分离与检测淋巴细胞功能测定细胞因子测定体内细胞免疫试验玫瑰花环试验T细胞亚群检测技术淋巴细胞转化试验细胞毒性T细胞试验巨噬细胞移动抑制试验白细胞介素测定干扰素测定皮肤试验5免疫制备技术抗原制备抗体制备抗体和细胞因子纯化淋巴细胞制备抗体标记与致敏•指制备与免疫检测有关的各种试剂，包括抗原制备、抗体制备及抗体标记等技术。6体内杀菌、溶菌、调理、中和毒素免疫病理损伤—超敏反应、免疫性疾病等体外：凝集、沉淀、溶细胞、中和毒素、补体结合等又称：serologicalreaction血清学实验第一节抗原抗体反应原理及特点7一、抗原抗体反应的原理基本原理：特异性（epitope----HVR）可见性（凝集、沉淀、溶血等）结合力(4种)8高度互补（epitope-HVR）紧密接触结合力抗原抗体带电离子异性相吸静电引力分子极化范德华引力形成氢键氢键引力形成疏水基团疏水作用力作用最小最具特异性作用最大抗原抗体结合可见反应比例合适9结合力的大小亲和力（affinity）亲合力（avidity）10一个抗体结合点与一个抗原表位间的结合强度。（singlepoint－singlepoint)亲和力用平衡常数表示：K=K1/K2亲和力（affinity）：即：结合常数/解离常数K值越大，亲和力越高，与抗原的结合越牢固11亲合力（avidity）指整个抗体分子与抗原之间结合的强度(allpoints-------allpoints)与抗体的结合价直接相关。亲合力高，与抗原结合牢固不易解离。12二、抗原抗体反应的特点（一）特异性（specificity）概念：一种抗原只能与其相应的抗体结合起反应Ag-epitopeHVR-Ab空间结构高度互补意义检测时常用已知Ag检测未知Ab，或反之。相对性：当抗原之间有相同或相似结构的epitope时（共同抗原）交叉反应（crossreaction）分子基础：13（二）比例性(proportionality)指抗原抗体的量比关系，即只有当抗原抗体的浓度比例适当时，才出现可见反应。1929年Heidelberger以固定Ab量逐渐增加Ag量的试验发现带现象。1977年Green把此现象称为钩状效应（hookeffect），包括前后带现象。指免疫检测中由于抗原、抗体浓度比例不合适而致检测结果呈假阴性的现象。14抗原抗体反应比例性示意图151、带现象:在抗原抗体反应等价带前后,由于抗体或抗原过量,上清液中可测出游离的抗体或抗原,形成的沉淀物少,不出现可见反应,这种现象称为带现象2、等价带:抗原抗体反应曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围,称为抗原抗体反应的等价带。在此范围内,抗原抗体充分结合,沉淀物形成快而多。3、前带现象:抗体量过剩时,不出现可见反应。4、后带现象:抗原量过剩时,不出现可见反应。16抗体的两个Fab段分别结合两个epitope，相互交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物（可见）。网格学说17Ab/Ag过剩过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物（不可见）。18（三）可逆性（reversibility）解离1.Ag+AbAg-Ab一定条件（动态平衡）动态平衡公式:[Ag]+[Ab][Ag-Ab]K1:结合常数；K2：解离常数K1K219（四）阶段性数秒～数分钟，肉眼不可见数分～数小时肉眼可见两个阶段特异性结合可见反应阶段20（一）电解质作用：中和胶体表面电荷，破坏水化层，使Ag-Ab聚集。常用：0.85%生理盐水，PBS、Ca2+、Mg2+等。盐析（salting）即电解质浓度过高引起的非特异性蛋白质沉淀。三、影响抗原抗体反应的因素21（二）酸碱度•Ag、Ab多为蛋白质，具两性电离特性，有固定的等电点，pH过高或过低均可影响Ag、Ab反应一般：pH6～8为宜。•注意：自凝——即pH达到或接近抗原的pI时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。酸凝——pH过低时造成的蛋白质自凝现象。22（三）温度—影响反应速度一般：15～40℃为宜，最适温度：37℃,过高（56℃）:Ag-Ab解离，Ag、Ab变性。23免疫学检测技术的评价标准Specificity（特异）：检测信号针对性和排他性Sensitivity（灵敏）：可测出的最低含量Simplicity（简便）：操作是否方便Safety（安全）：是否有污染，对操作者的伤害Saving（节约）：性能/价格比24免疫检验技术发展进程的主要阶段自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合25抗原抗体反应的基本类型表反应类型实验技术检测方法敏感度沉淀反应液相沉淀试验观察沉淀、检测浊度+，++++琼脂凝胶扩散观察扫描沉淀线或环+凝胶电泳技术或峰或弧++补体参与反应补体溶血试验以裸眼或光电比色仪++补体结合试验观察测定溶血现象+++免疫标记技术荧光免疫技术检测荧光现象++++放射免疫技术检测放射性++++酶标免疫技术检测酶底物显色++++发光免疫技术测定发光强度++++生物素-亲合素技术结合其它标记技术++++金标免疫技术检测金颗粒沉淀++++凝集反应直接凝集试验用裸眼、放大镜或显+间接凝集试验微镜观察红细胞或胶++凝集抑制试验乳等颗粒和各种凝集+++协同凝集试验现象+++抗球蛋白试验+++中和反应病毒中和试验病毒感染性丧失+毒素中和试验外毒素毒性丢失++26一、凝集反应（Agglutination）颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反应。第二节基于Ag-Ab反应的检测方法27282、凝集反应的用途（1）定性检测即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性（2）定量检测即将标本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现50%凝集的最高稀释度作为滴度。凝集反应方法简便，敏感性高，临床应用广泛。293、凝集反应的分类玻片凝集反应试管凝集反应30（一）直接凝集试验（Directagglutination）311、玻片凝集试验322、试管凝集试验33（二）间接凝集试验indirectagglutination34已知抗原检测抗体已知抗体检测抗原正向反向351、正向间接凝集反应362、反向间接凝集反应373、间接凝集抑制反应384、协同凝集反应（coaggoltination）39可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。二、沉淀反应40液相沉淀反应凝胶扩散沉淀凝胶免疫电泳絮状沉淀环状沉淀免疫浊度沉淀单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验血清免疫电泳火箭电泳对流免疫电泳免疫印迹等411、絮状沉淀试验操作步骤：（1）将可溶性抗原作一系列倍比稀释。（2）各管加入一定浓度的适量抗血清。（3）振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。（4）产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。（一）液相沉淀反应422、环状沉淀试验操作步骤：（1）用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免产生气泡。（2）将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（3）置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。（诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。433、凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。最常用的方法为：①单向琼脂扩散试验②双向琼脂扩散试验44（1）单向琼脂扩散试验原理：1％～2%的琼脂凝胶形成网状构架，空隙中是98％-99%的电解质溶液。凝胶网孔较大，允许分子量在200kD以下甚至更大些的大分子物质通过，绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在200kD以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处发生沉淀，此沉淀物因颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。45单向免疫扩散试验示意图环的直径与抗原含量成正相关46（2）双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散时，在两孔间可出现沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。47483、免疫电泳技术免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。两大优点：一是加快了沉淀反应的速度二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等49（1）血清免疫电泳将抗原混合物在凝胶中用电泳分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加。5051(2)对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术52（3）火箭免疫电泳火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。53是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的蛋白成分。广泛应用于检测蛋白的表达。（4）免疫印迹westernblot54kDaM123456907560402555免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核素等标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应。免疫标记技术既可对样品作定性、定量检测，也可进行定位分析，且大大提高了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。四、免疫标记技术56常见标记免疫技术放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术化学发光免疫技术免疫胶体金技术免疫印迹技术蛋白质芯片技术59是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的灵敏度（pg）和自动化检测等特点，因此在实验研究和临床检测中仍被广泛应用。主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等小分子化合物的定量分析。1.放射免疫技术60放射免疫分析－基本原理竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力61Ag*AbAg标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性放射免疫测定法(RIA)示意图62将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体，制成荧光抗体诊断试剂。用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断抗原的存在、定位和分布情况。免疫荧光技术有直接法和间接法等。2.免疫荧光技术63免疫荧光技术——直接法Ag荧光素标记的特异性抗体组织切片或细胞64免