7核酸类物质 (1)

核酸类物质一、概述核酸类物质的生产现状核酸类产品的应用核酸类药物生产方法1.RNA和DNA二天然结构的核酸类药物2、核苷酸的生物合成2.1.嘌呤核苷酸的合成2.2嘧啶核苷酸的合成三、鸟苷(鸟嘌呤核苷)四、肌苷酸五、辅酶A一、概述核酸的基本结构是核苷酸。核酸由众多的单体核苷酸通过3,5－磷酸二酯键聚合而成。核苷酸由碱基（A,T,C,G,U）、核糖、磷酸组成。脱去磷酸后的碱基称为核苷。核酸类物质的生产现状历史1960年，日本科学家发现5-IMP具有强烈鲜味。60年代后期，日本成为用发酵法生产核苷酸类物质的最大生产国。市场上的“强力味精”、“加鲜味精”是在普通的味精中加少量肌苷酸钠组成。70年代以后，核酸类物质及其衍生物以其具有抗病毒和抗肿瘤的作用，受到医药界的普遍重视。核酸类产品的应用作为增味剂的主要成分作为临床治疗的核酸类药物叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）、阿糖腺苷（Adeninearabinoside）、三氮唑核苷在农业上：浸种、蘸根及喷雾生产方法1.发酵法：发酵法核苷核苷酸2.酶解法（5’-磷酸二脂酶）酵母核糖核酸核苷酸3.半合成法（发酵和合成配合使用）由于发酵法生产核苷的效率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，收率可达90%以上。磷酸化提取酵解二天然结构的核酸类药物RNA和DNA2、核苷酸的生物合成利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及CO2等简单物质为原料合成嘌呤核苷酸的过程，称为从头合成途径或全合成途径，是体内主要合成途径。利用体内游离嘌呤或嘌呤核苷，经简单反应过程生成嘌呤核苷酸的过程，称为补救途径。2.1.嘌呤核苷酸的合成1）嘌呤核苷酸的从头合成途径一碳单位一碳单位天冬氨酸甘氨酸谷氨酸嘌呤核苷酸环上的原子来源由氨基酸、磷酸戊糖、CO2和NH3合成核苷酸。嘌呤核苷酸的全合成途径：直接生成次黄嘌呤核苷酸（IMP）,然后转变为其它嘌呤核苷酸。由IMP合成AMP及GMP葡萄糖5’－磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸（PRPP）PRPP转酰胺酶5-IMPAMPSAMPXMPGMP①腺苷酸代琥珀酸合成酶③IMP脱氢酶②腺苷酸代琥珀酸裂解酶④GMP合成酶由IMP合成AMP及GMP2）嘌呤核苷酸的补救合成途径与全合成不同，补救合成过程较简单，消耗能量也较少。3）嘌呤核苷酸从头合成的调节2.2嘧啶核苷酸的合成嘧啶核苷酸环上的原子来源嘧啶环的前体是氨甲酰磷酸和天冬氨酸。C2来自HCO-3；N3来自谷氨酰胺的酰胺基团；其余原子都来自天冬氨酸。各种嘧啶核苷酸的前体是尿嘧啶核苷酸(UMP)，尿嘧啶核苷酸从头合成的过程比嘌呤简单，并且消耗的ATP少。1）嘧啶核苷酸的从头合成途径UMP的合成由UMP转换成CTP涉及三步反应。尿苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸转移给UMP，形成UDP。核苷二磷酸激酶催化第二个ATP的γ-磷酸转移给UDP，形成UTP。CTP合成酶催化来自谷氨酰胺的酰胺氮转移至UTP的C-4，形成CTP。利用外源的或核苷酸分解代谢生成的嘧啶碱和嘧啶核苷生成嘧啶核苷酸。尿苷激酶途径尿苷+ATP尿苷酸+ADP2）嘧啶核苷酸的补救合成途径3）嘧啶核苷酸从头合成的调节大肠杆菌嘧啶核苷酸的合成：第一个调节位点是氨甲酰磷酸合成酶，是嘧啶核苷酸生物合成途径的关键酶。代谢受到双重调节控制。第二个调节位点是由天冬氨酸氨基甲酰转移酶催化N-氨甲酰天冬氨酸的合成反应，受UTP、UDP和UMP等尿嘧啶核苷酸以及终产物CTP的反馈抑制。第三个调节位点是CTP合成酶催化的反应，受CTP的反馈抑制。三、鸟苷(鸟嘌呤核苷)1.鸟苷的生物合成及代谢调节由于枯草芽孢杆菌具有GMP环形支路，该菌株应该丧失SAMP合成酶活性，切断从IMP到AMP的通路，使生成的IMP不变为AMP，全部转向合成GMP，同时还需要丧失GMP还原酶活性，再切断由GMP到IMP的反应，使生成的GMP不至还原为IMP。核苷酸或核苷磷酸化酶等鸟苷分解酶的活性必须微弱。必须解除GMP对PRPP转酰胺酶，IMP脱氢酶及GMP合成酶等的反馈抑制与阻遏。由IMP脱氢酶及GMP合成酶所催化的反应比核苷酸酶所催化的反应优先进行。PRPPPRA5’-IMPIRXMPGMPSAMPAMPADP合成途径优先合成反馈抑制反馈阻遏枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调节机制2.鸟苷的生产菌枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌、微黄短杆菌、铜绿假单胞菌等。3.鸟苷的发酵工艺培养基碳源；氮源；无机盐；嘌呤前体物；营养缺陷型菌株的营养物质。培养条件投料量和接种量；温度；pH；罐压与通风比。4.鸟苷的提取工艺发酵结束，加入絮凝剂，搅拌均匀升温，趁热以板框压滤机过滤，收集滤液，并以沸水洗涤滤饼，合并滤液，冷却结晶，得粗品。粗品加水、活性炭脱色，压滤，洗涤，合并滤液，冷却结晶，得产品。四、肌苷酸(次黄嘌呤核苷酸或次黄苷酸)肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加2%，鲜度可增加3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。1.生物合成及代谢调控1.肌苷酸的生物合成及代谢调控产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸发酵机制:积累IMP的主要前提：（1）阻断SAMP合成酶:即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量腺嘌呤，以满足菌体生长；（2）保持PRA合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步反应；（3）要使IMP渗出胞外，选育对Mn+不敏感菌株；（4）生成的IMP不被降解，恰好原菌株该酶活力低。2.产生菌主要有产氨短杆菌、谷氨酸棒杆菌、谷氨酸小球菌、嗜醋酸棒杆菌等。其中产氨短杆菌使用较多。国外采用枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌的营养缺陷型、抗代谢类似物、锰离子不敏感、抗生物素菌株。3.发酵工艺4.肌苷酸的提取工艺采用活性炭吸附法和离子交换树脂法。吸附法收率为40-50%，离子交换法为60%以上。发酵液过滤酸化阳离子树脂吸附流出液碱化阴离子树脂吸附洗脱减压浓缩溶解结晶溶解重结晶产品精品肌苷酸的提取工艺五、辅酶A1.辅酶A的生物合成及代谢调控以泛酸为原料，被激酶磷酸化的泛酸和半胱氨酸结合生成4’-磷酸-泛酸-半胱氨酸，接着在半胱氨酸上脱羧基生成4’-磷酸泛酰巯基乙胺，然后与ATP缩合生成脱磷辅酶A，最后在腺苷3’-位上导入磷酸基，生成辅酶A。泛酸4’-磷酸泛酸4’-磷酸-泛酸-半胱氨酸4’-磷酸泛酰巯基乙胺3’-脱磷-CoACoA反馈抑制CoA生物合成调节2.产生菌有面包酵母、产氨短杆菌、大肠杆菌、藤黄八叠球菌、谷氨酸棒状杆菌等。常用的有产氨短杆菌和藤黄小球菌。3.发酵工艺1）培养基由于CoA生物合成每一步反应都需要ATP，高浓度葡萄糖及磷酸盐能提供充分的ATP。碳源：葡萄糖。果糖、麦芽糖、蔗糖不产CoA氮源：单独使用无机盐不产CoA，要与有机氮混合使用，可获较高产量的CoA。Mg2+和Mn2+对CoA有促进作用。表面活性剂的添加对CoA有促进作用。2）培养条件4.提取工艺提取方法有铜盐工艺、离子交换树脂吸附法等。最常用的是离子交换树脂吸附法。辅酶A可分为氧化型和还原型，提取方法也不同。1）阴离子交换树脂提取还原型CoA2）阴离子交换树脂提取氧化型CoA