【生物技术】第四讲 植物组织培养的理论基础

第四讲植物组织培养的理论基础第一节植物细胞的全能性一、细胞全能性的概念任何具有完整的细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，即细胞具有全能性。细胞全能性概念随着实践的发展逐步完善。1934年，White首次定义为:每个植物活细胞在合适的条件下，都有发育为胚的能力。20世纪70年代，扩大了以上定义范围，为：植物活细胞不但能形成胚状体，而且能发育为完整植株。目前细胞全能性定义为：每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢、应激性和自体复制等生命基本属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。应激性：是指生物体随环境变化的刺激而发生相应反应的特征。生物体的生存离不开环境条件，而环境又是不断变化的。除四季有规律的变化外，还有些急剧变化，如干旱、涝灾、高温、低温、昆虫侵害等等。生物体具有“某种机制”来感知和正确估计环境的变化，以便在体内加以校正，保证体内平衡，来应付突变的环境。如有植物种子休眠期很长，可以避开旱、涝、冷、热等恶劣环境（如：500年前莲子发芽,沙漠绿洲）。有的植物对虫蛀有应激反应，虫蛀后，非但不减产，甚至还能增产。变色龙的变色、壁虎的尾巴等等。自我复制：是指生物体利用自身作模板，通过代谢作用，复制出完全相同的结构，或产生也具有相同的自体繁殖能力的突变结构。前者为“遗传”，后者为“变异”。“遗传”保证了物种的纯化，“变异”为物种的进化提供依据。自我复制实现了遗传与变异的矛盾统一。自我复制方式因繁殖方式不同而不同。无性繁殖植物通过体细胞分裂即可实现自我复制。有性繁殖植物自我复制必须通过配子体世代和孢子体世代，即：受精卵———→组织分化、器官形成—→性成熟————→配子—→合子（受精卵）减数分裂细胞分裂精子卵子二、离体培养细胞展现该物种的生命特性（一）培养细胞的新陈代谢在适宜条件下，离体细胞能够存活，则具有新陈代谢特性。如：绿色细胞具有光自养能力；固氮植物细胞具有固氮特性；培养细胞具有该物种的“药物生物合成的能力”。（二）应激性在适宜培养条件下，离体细胞具有应激性，表现在：非绿色细胞应变出对培养和环境的对应方式，以异养方式生存并发展。依靠培养基供给营养来生存。植物组织切割损伤后，应激于培养条件而出现脱分化，并在适宜的条件下再分化（芽和根）。（三）培养细胞展现自体复制特性脱分化植物组织――→愈伤组织（脱分化细胞）再分化—―→植株脱分化细胞、原生质体――→再分化愈伤组织—―→植株细胞分裂原生质体融合――→愈伤组织再分化―→植株以上实例证明：细胞分裂以及植株再生展现了培养细胞自体复制的特征属性。第二节脱分化与再分化脱分化：具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程称为脱分化。（如根、茎、叶）再分化：是指离体培养物可以由脱分化状态再度分化。包括细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。一、外植体脱分化如茎段、根段、叶柄段、叶片、花药、花粉、幼胚等。（一）诱导期间的细胞生物学变化植物组织从母体上切割下来后，会发生一系列细胞学及生物化学方面的变化。1）细胞结构变化：细胞核形状及外表变化，染色体的凝集，线粒体外形及数量改变等等。2）代谢及生化变化：气体交换率增加，核糖体出现，有关酶的增加等。（二）与脱分化有关的因子及其作用任何具有完整的细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，即细胞具有全能性。这种植物所具有的全能性只是一种可能性。细胞全能性所需要的条件：⑴离体损伤刺激；⑵营养物质及激素的刺激；⑶培养温度、光照等的影响。⑴离体损伤刺激要使植物组织或细胞经脱分化再生植株，必须从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，即处于离体条件(正常植株叶片上不会再长植株或愈伤组织)。离体损伤刺激是细胞脱分化的重要条件之一。损伤刺激会使细胞呼吸速度增大，称为“损伤呼吸”，酶的活性增加，代谢物含量变化。⑵生长物质的影响细胞离体后，以异养方式生存，所以必须给与营养物质（培养基）。另外，还必须给与激素刺激，以打破抑制力，恢复细胞分裂。抑制假说：认为静止细胞仍然保存着在分生组织状态时的那种细胞分裂潜能，只不过存在一种抑制物质或抑制力，使细胞分裂能力不能表现。如果去除这种抑制，细胞就恢复到分裂状态。这种抑制剂的作用原理及作用位点尚不清楚，但其抑制效能可能会在生长调节物质（激素）的作用下而失掉，从而使细胞恢复分裂能力，实现脱分化。不同植物细胞内，抑制剂的质和量可能是不同的。因此，在组织培养中，往往因植物不同，培养基中添加激素的种类和浓度以及配比也不同。⑶培养细胞的异质性在组织培养中，往往某一部分细胞能脱分化，而其它细胞则不能，表现为异质性。⑷光照和温度的影响各种植物对光照和温度的要求不同。有的植物需要在黑暗条件下诱导愈伤组织；但也有的植物在光照条件下诱导愈伤组织，其植株再生率更高。对温度的要求，往往耐高温植物或起源热带植物，所需培养温度较高（如甘薯）；而耐低温植物，培养温度较低。一般植物培养温度在25℃左右。二、愈伤组织的生长经脱分化导致细胞――→具备了分裂能力――→结果细胞不断增殖――→愈伤组织的生长愈伤组织的生长1诱导期外植体细胞进行分裂准备的时期。外植体细胞外形没多大变化，但细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。愈伤组织的生长2分裂期外植体细胞开始迅速分裂，但外植体中间部分不分裂。细胞分裂高峰期的标志：细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，RNA含量最高。愈伤组织的生长3形成期指外植体细胞经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。细胞分裂由原来局限在外缘的平周分裂转为组织内部的较深层局部分裂。平周分裂（横向分裂）：使细胞层数增多，组织加厚。垂周分裂（径向分裂）：使同一层细胞数量增多，使表面积增大。愈伤组织的生长并非一致进行，待细胞分裂到一定时期，便会停止分裂。但如果把处在旺盛生长且未分化的愈伤组织切成小块进行继代培养，可维持其活跃生长。利用此特点，进行继代培养，可大量增殖。也有例外，有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官。优良愈伤组织一般应具备的条件：1旺盛的自我增殖能力，以便于用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。2容易散碎，以便于用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要的时候能从中分离出全能性的原生质体。3高度的胚性或再分化能力，以便于从这些愈伤组织得到再生植株。4经过长期继代培养而不丧失胚性，以便于可能对他们进行各种遗传操作。为达到以上目的，诱导愈伤组织采取的策略1选择合适的基因型和适当的外植体2选择合适的培养基3采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件例子：玉米幼胚愈伤培养，5mg/L硝酸银，抑制组织内乙烯的作用。根据对一些禾谷类植物体细胞愈伤研究，将愈伤分3个类型：1结构致密，生长较慢，容易分化成苗，称为保守分裂型2结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖较快，称为亢进分裂型3结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡，称为衰败型。三、细胞分化和组织分化（一）细胞分化及其影响因素细胞分裂分化成什么样的细胞，是拟分生组织细胞，还是维管组织细胞，或是其它细胞?影响细胞分化的因素：1.生长调节剂（激素）。培养基中添加生长素、细胞分裂素等的种类、浓度及配比。2.培养基种类（营养成分）3.糖类物质。例如培养基中添加蔗糖浓度，过低、过高都不利，一般在2.5%—3%比较适宜。4.其它理化因子。如光照时间、光照强度、培养温度、培养基pH值等。（二）组织分化在细胞分化的基础上，可以分化出各种各样的组织。其中，拟分生组织和维管组织是两种重要的组织。是形成不定芽和不定根的基础。拟分生组织：是指培养物中出现的类似分生组织的细胞群，它是脱分化后的培养物发生一系列细胞分裂而产生的一团小型、薄壁、液泡小的细胞组织。也叫做生长中心或分生组织结节。拟分生组织可以从一个细胞或几个细胞形成，可以起源于愈伤组织的表面，也可以起源于组织内部。在拟分生组织形成的同时或稍后，愈伤组织中会分化出维管组织结节。维管组织结节：是指一个区域的愈伤组织转化为韧皮分子和木质分子的混合结构（类似形成层）。这种形成层状的细胞向外延伸与拟分生组织连接，形成芽原基或根原基。四、器官分化和植株形成脱分化组织（细胞）――→形成愈伤组织―→细胞分化―→组织分化（拟分生组织和维管组织节结）―→器官分化（芽和根）―→植株形成（一）、器官分化器官分化主要指根和芽的分化。是否能够发生器官分化，与前培养有关，如脱分化、细胞分化、组织分化等。有了前边这些分化才会有器官分化。影响器官分化的因素：1．培养基中添加激素的种类、浓度及其配比。这是最主要的影响因素。（具体后述）2．培养基中添加其它成分，如水解蛋白、嘌呤类、嘧啶类、氨基酸等。3．物理因素。如培养温度、光照时间、光照强度等（二）、完整植株的形成植株再生途径：器官分化途径体胚分化途径器官分化途径：1先分化芽，等芽伸长后在其幼茎基部长根，形成完整小植株2先分化根，再在根上产生不定芽而形成完整植株3在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后二者的维管组织互相连接，成为小植株。除上述之外，还有两种情况，不经脱分化而直接长成植株：直接伸长茎尖培养（较大时）――→完整植株发育幼胚培养（较大时）――→完整植株五、体细胞胚胎发生（Somaticembryonenesis）在组织培养中，起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。体细胞胚发生时期单细胞小细胞团球形期鱼雷形期心形期体细胞胚（Somaticembyo）的发生来源1．从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚，中间不经过愈伤阶段。2外植体先愈伤化，然后由愈伤组织内分化产生体胚。有些植物种子需要冷处理才能打破休眠而发芽，这些植物的体细胞胚往往也需要冷处理，才能萌发长成植株。如葡萄的体胚需在4℃下处理2周，才能发芽。全息性细胞全能性的利用人工种子：1体胚2人工胚乳（促进生长的微生物、营养物质、杀虫剂等）3种皮（褐藻酸钠+氯化钙）