酵母菌的酒精发酵

第五章发酵机制与代谢调控微生物发酵机制是指微生物通过其代谢活动，利用基质合成人们所需要的产物的内在规律。糖酵解（EMP）途径是葡萄糖有氧、无氧分解的共同途径。在缺氧条件下，细胞进行无氧酵解，仅获得有限的能量以维持生命活动，丙酮酸继续进行代谢可产生酒精、乳酸、甘油及其它厌氧代谢产品。在有氧条件下，细胞进行有氧代谢生成丙酮酸后，进入TCA循环。其发酵产品有柠檬酸、氨基酸及其它有机酸等。EMP途径34一、酵母菌的酒精发酵（酵母的第Ⅰ型发酵）1.生物合成途径第一节厌氧发酵机制与代谢调控5总反应式为：C6H12O6+2ADP+2H3PO42CH3CH2OH+2CO2+2ATP理论转化率为：%1.51%1001.18005.462CO2产量约为酒精质量的95.5%实际转化率为理论值的95%，约48.5%6酒母水溶液中连续发酵pH4.5左右30~33℃60~72h酒母不含淀粉酶，主要含水解酶（如蔗糖酶、麦芽糖酶）和酒化酶（指参与酒精发酵的各种酶和辅酶的总称，胞内酶）。酒糟的利用酒精是胞内产物渗出体外与H2O任比例混合7CO2产量约为酒精质量的95.5%，而且纯度相当高，只需经过简单的提纯处理，便可得到几乎纯粹的CO2。可以用来生产液体CO2、干冰、纯碱和轻质碳酸钙等。C6H12O6+2ADP+2H3PO42CH3CH2OH+2CO2+2ATPCO2溶解度较小被动式发酵泡沫式发酵不利产生的CO2应设法排除，并注意加强对随CO2逸出时被带走酒精的捕集回收。82.▲巴斯德效应(Pasteureffect)巴斯德在研究酵母的酒精发酵时，发现在有氧的情况下，由于进行呼吸作用，酒精产量大大下降，糖的消耗速度减慢，这种呼吸抑制发酵的作用被后人称为巴斯德效应。9巴斯德效应PFK受高水平的ATP、柠檬酸、脂肪酸所抑制，能被AMP、ADP活化己糖激酶被G-6-P、PEP抑制丙酮酸激酶受高水平的ATP抑制，被FDP激活PEP10主要产物是乙醇和CO2，但也伴随有40多种副产物（包括甘油和杂醇油）。副产物生成一方面耗用了糖分，同时影响了产品的质量。3.酵母菌酒精发酵中副产物的生成酵母菌的酒精发酵又称酵母的第Ⅰ型发酵酵母的第Ⅱ型发酵习题：酵母可以依赖Glc厌氧或有氧生长，试解释当一直处于厌氧环境中的酵母细胞暴露于空气中时，Glc的消耗速率为什么会下降？11二、细菌的酒精发酵Glc只经过4步反应就可形成Pyr少数假单胞杆菌在ED途径中生成的2分子的丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛还原生成乙醇12三、乳酸发酵机制有同型乳酸发酵和异型乳酸发酵两种类型。前者在发酵产物中只有乳酸，后者的产物中除乳酸外，还有乙醇和CO2。两者的发酵菌种不同，发酵机制也不同。1、同型乳酸发酵乳酸菌德氏乳杆菌大多数乳酸菌不具有脱羧酶葡萄糖3-磷酸甘油醛1,3-二磷酸甘油酸2NAD2NADH+H+2ATP2ADP4ADP4ATP丙酮酸NADNADH+H+乳酸乳酸脱氢酶13总反应式为：2CH3CHOCOOH+2ATPC6H12O6+2ADP+2H3PO4理论转化率为：%100%1001802902、异型乳酸发酵（1）6-磷酸葡萄糖酸途径1mol葡萄糖生成1mol乳酸和lmol乙醇。乳酸对糖的理论转化率是50％。肠膜明串珠菌和葡聚糖明串珠菌等。14（2）双歧途径双歧杆菌在这个途径中，2molGlc可以生成2mol乳酸和3mol乙酸，乳酸对糖的转化率理论上只有50%。15四、甘油发酵机制H2COHCHOHH2COH甘油（丙三醇）1、亚硫酸盐法甘油发酵酵母菌酵母的第Ⅱ型发酵良好溶剂，广泛用于化妆品和医药行业；炸药。16发酵液中加入亚硫酸氢钠(NaHSO3)亚硫酸钠加成物()CH3CHOSO2NaOH▲原理：阻遏乙醇的生物合成乙醇脱氢酶171.从能量守恒可知，要生成甘油则必须有等摩尔量的乙醛生成。即酵母进行甘油发酵时必须依靠部分酒精发酵以获得能量（ATP和NADH+H+）。2.生成部分乙醇不可避免。因为乙醛与NaHSO3复合反应效率低于89%；且酵母体内有乙醇脱氢酶存在。实际上甘油发酵过程中总会有一些乙醇生成，因为：C6H12O6C3H5(OH)3+CH3CHO+CO2总反应式为：酵母的第Ⅱ型发酵182、碱法甘油发酵酒精酵母酵母的第Ⅲ型发酵如果碱性（pH值7.6以上）两分子乙醛发生歧化反应形成各一分子的乙酸和乙醇。2C6H12O6+H2O2C3H5(OH)3+CH3COOH+C2H5OH+2CO2产物复杂19五、甲烷（沼气）发酵甲烷发酵的机理是厌氧菌将碳水化合物、脂肪、蛋白质等复杂的有机物最终分解成甲烷和CO2。复杂有机物低级脂肪酸甲烷、CO2等可溶性简单有机物（醋酸、丙酸、丁酸等）发酵细菌产酸菌产气菌（严格嫌气菌）产酸阶段（兼性厌氧）三阶段废物利用第二节好氧发酵机制与代谢调控一、柠檬酸发酵机制1.柠檬酸及其衍生物的用途（1）食品工业：酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除腥脱臭剂、螯合剂等；（2）药物、化妆品；（3）工业上：去垢、无土栽培、胶粘剂等。（4）柠檬酸盐类具有溶解度高、生理宽容性大、酸根可直接吸收和代谢。补钾、抗凝血、柠檬酸钠。（5）柠檬酸酯（三酯等）：树脂增塑剂（抗霉），化工原料，药物等。21菌种：黑曲霉和假丝酵母好氧发酵发酵原料：玉米、干薯、木薯、小麦、糖蜜等。2.柠檬酸的生物合成途径黑曲霉偏好于无机氮源。无机氮源被利用后，对M的pH值有影响。T：黑曲霉生长最适33℃~37℃，柠檬酸积累32℃。pH值：黑曲霉生长最适pH3~7，柠檬酸积累pH2。22EMPTCA柠檬酸的生物合成途径56723要使柠檬酸积累，必须解决两个问题：（1）设法阻断柠檬酸的进一步代谢；可见，由Glc生成柠檬酸的生物合成途径包括:EMP、TCA循环和CO2固定作用。（2）途径被阻断后，要采取合适的策略来补充阻断点之后的物质（主要是草酰乙酸），以维持发酵的继续进行。24（1）阻断柠檬酸的进一步代谢：使顺乌头酸酶失活Fe2+是顺乌头酸酶的激活剂加络合剂（2）加强EMP途径增强3个关键酶尤其是PFK的活力PFK受高水平的柠檬酸和ATP抑制；NH4+能解除此抑制∴氮源用NH4+盐（铵盐）3.柠檬酸积累的代谢调节柠檬酸发酵时要求Mn2+、Fe2+、Zn2+的含量极低25Mn2+缺乏导致细胞内NH4+水平升高。NH4+水平升高减弱了柠檬酸对EMP途径关键酶（PFK）的抑制。Mn2+是许多酶的组成部分。柠檬酸发酵时对Mn2+极端敏感。（3）TCA循环的调节增强柠檬酸合成酶的活性（4）及时补加草酰乙酸TCA循环被切断,必须由另外的途径来补充草酰乙酸。26×√√√加强CO2固定反应×主要黑曲霉中没有苹果酸酶草酰乙酸的来源28氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由于发酵产物氨基酸都是M.B的中间代谢产物，它的积累是建立在对M.B正常代谢的抑制。也就是说，氨基酸发酵的关键是取决于能否打破M.B的正常代谢调节，人为地控制M.B的代谢。细胞经济与生产经济矛盾三、谷氨酸发酵机制294-P-赤藓糖HMSGEMPPEPTCA3-P-甘油醛SerCyshGly莽草酸TrpPheTyrPyrAlaValIeuα-酮戊二酸草酰乙酸GluGlnArgProAspAsnIleThrMetLys30HOOC—CH2—CH2—CH—COONa·H2ONH2（一）Glu的用途1.味精合成前体2.Glu可以通过转氨反应把氨基转移到酮酸上，合成人体代谢所需的其它氨基酸。HOOC-C-ROα-酮戊二酸+HOOC-CH-RGlu+NH2转氨酶3.解“氨毒”谷氨酰胺（Gln）31H2NCCOOHHR氨基酸H2NCCOOHHCH2NH3L-谷氨酸L-谷氨酸脱氢酶CH2COOHα—酮戊二酸CCOOHCH2CH2COOHOCCOOHROα—酮酸转氨酶32（二）Glu生物合成途径及调节机制1.合成途径（2）以乙酸作为碳源（1）以糖质原料（最后水解为Glc）作为碳源谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及发酵条件的适合。33由生物合成的代谢途径GlcGluGlcG-P-63-磷酸甘油醛6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸核糖OHMP途径（约占26%）EMP途径（为主）DCA循环TCA循环乳酸34DCA循环TCA循环以乙酸为唯一碳源生物合成的代谢途径Glu35注意：（1）产物为L-型（2）需要引入NH4+（但要适量），产物一般以谷氨酸铵盐的形式存在：C5H8O4N•NH436谷氨酸生产菌：棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。2.谷氨酸生产菌▲谷氨酸生产菌有以下共同特征：（1）都是需氧型微生物；（2）都是生物素缺陷型；（3）发酵中菌体发生明显的变化，同时发生细胞膜渗透性的变化；（4）CO2固定反应酶系活力强；（5）α-酮戊二酸脱氢酶活力缺失或微弱；37（6）柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及Glu脱氢酶活力强；（7）能利用醋酸；（8）具有向环境中泄漏Glu的能力；（9）不分解利用Glu，并能耐高浓度的Glu；（10）Glu对Glu脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。因此，前述两种生物合成Glu的途径应为：38因为Glc抑制异柠檬酸裂解酶的活性，故异柠檬酸的分解反应微弱。乳酸39DCA循环403.有关Glu代谢途径的解释（1）以Glc为碳源的代谢途径①许多研究证明：以Glc为C源时，糖酵解经EMP和HMP两个途径进行，但是以EMP为主（占74%）。②当TCA循环有缺陷时，DCA循环起补充四碳二羧酸的作用。*C4二羧酸：草酰乙酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸。③如果C4二羧酸完全由CO2固定反应提供：41DCA循环乳酸42此时，Glu对Glc的理论收率为81.7%总反应式为：C6H12O6+NH3+3/2O2C5H9O4N+CO2+3H2O④在Glu生成期，若CO2固定反应完全不起作用，C4二羧酸完全由DCA循环提供：43延胡索酸琥珀酸乳酸44反应如下：3C6H12O66丙酮酸6醋酸+6CO26醋酸+2NH3+3O22C5H9O4N+2CO2+6H2O此时，Glu对Glc的理论收率仅为54.4%∴在Glu生成期，最好没有异柠檬酸裂解反应，应关闭DCA循环。*在菌体生成期，可走DCA循环。实际收率处于中间值（54.4%~81.7%）。CO2固定反应与DCA循环的比率对Glu的产率有影响，后者的活性越高，Glu的生成收率越低。45所以，由Glc生成Glu的理想途径为：四碳二羧酸完全由CO2固定化反应提供。46（2）以乙酸为碳源的代谢途径DCA循环是四碳二羧酸的唯一来源。（3）两种途径中，细胞内α-酮戊二酸与异柠檬酸的量需维持平衡。异柠檬酸a-酮戊二酸L-GluNADP+NADPH+H+NADP+NADPH+H+NH4+异柠檬酸脱氢酶L-Glu脱氢酶反馈抑制474.由Glc生物合成Glu的调节机制（1）α-酮戊二酸脱氢酶在Glu产生菌中先天性的缺失或微弱（尤其是在生物素缺乏的条件下)，TCA循环到达α-酮戊二酸即受阻。（2）Glu产生菌中的L-Glu脱氢酶的活力很强，α-酮戊二酸在Glu脱氢酶催化下氨基化生成Glu（需引入NH4+）。（3）通过控制生物素亚适量，引起代谢失调使Glu得以积累。生物素对糖代谢的调节生物素还影响细胞膜的通透性，后述48①生物素对糖代谢速度的影响生物素影响糖代谢的速度而不是EMP与HMP途径的比率。数据：生物素充足时HMP占38%，亚适量时26%。没有显著影响。*在生物素充足的条件下，Pyr趋于生成乳酸的反应。大量合成Glu所需要的生物素浓度比菌体生长的需要量低，即为菌体生长需要的“亚适量”。一般5~10μg/L②生物素对CO2固定反应的影响生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应。49DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。异柠檬酸裂解酶受Glc、琥珀酸阻遏，为HAC所诱导。③生物素对DCA循环的影响在以Glc为原料时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性，DCA循环基本上是封闭的。代谢流向异柠檬酸α-酮戊二酸Glu的方向高效率地移动。（4）∵Glu对Glu脱氢酶存在着反