雷公藤药材及制剂的HPLC指纹图谱研究

1专业：药物分析雷公藤药材及制剂的HPLC指纹图谱研究高旋*，庄莹，宋敏，翟清波，杭太俊(中国药科大学药物分析教研室，南京210009)摘要目的：建立雷公藤药材及制剂的HPLC指纹对照测定法，为雷公藤质量控制提供参考。方法：采用C18色谱柱，甲醇-水为流动相梯度洗脱，测定雷公藤药材及制剂的HPLC指纹图谱，统计分析确定共有模式；以最接近共有模式的雷公藤药材和制剂为指纹对照，采用夹角余弦法和相对欧氏距离法，分别从化学成分定性和含量两个方面对不同产地雷公藤药材和主要市售雷公藤片剂的HPLC指纹图谱进行定性与定量相似性评价。结果：建立的雷公藤药材及制剂的HPLC指纹图谱测定条件分离良好、专属性强，可用于全面控制雷公藤的质量。结论：以指纹对照品为参照进行雷公藤药材及制剂指纹图谱相似性评价，重复性和耐用性良好。测得雷公藤药材及制剂的指纹特征差异显著。关键词：雷公藤药材；雷公藤片剂；雷公藤内酯醇；指纹图谱；高效液相色谱法2StudyofTripterygiumwilfordiiHook.fandtripterygiumtabletsbyHPLCFingerprintChromatogramGAOXuan,ZHUANGYing,SONGMin,ZHAIQing-bo,HANGTai-jun(ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)AbstractObjective:ToestablishastableandrepeatableHPLCreferencefingerprintchromatogramstandardforthequalityanalysisandcontrolofTripterygiumwilfordiiHook.f.anditspreparations.Methods:HPLCseparationwasperformedonaC18columnwithmethanol-waterasmobilephaseinagradientelutionmode.ThereferencefingerprintchromatogramwasdeterminedasthemosttypicalchromatogramthatrepresentedmostpropertiesofTripterygiumwilfordiiHook.f.andtripterygiumtablets,respectively,frombothconstitutesandquantityviewofpoints,establishedbystatisticalandsimilarityanalyses.Results:TheresultsindicatethatthequalityassessmentsofTripterygiumwilfordiiHook.f.andtripterygiumtabletswithreferencetotheconcomitantlymeasuredHPLCreferencefingerprintchromatogramshavegoodruggedness,specificity,andreproducibility.Conclusion:ThefingerprintchromatogramsofTripterygiumwilfordiiHook.f.anditspreparationscanbequantitativelyandqualitativelyevaluatedbycomparisonwiththeestablishedfingerprintreferencestandardsbyusingCosineandrelativeEucliddistancemethods,respectively.ThefingerprintchromatogramsofbothTripterygiumwilfordiiHook.f.anditspreparationsvariessignificantly.Keywords:TripterygiumwilfordiiHook.f.;tripterygiumtablets;triptolide;fingerprintchromatogram;HPLC作者简介:高旋，女，药物分析硕士研究生Tel:[phone]E-mail:[e-mail]3雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)系卫矛科雷公藤属植物，产于浙江、安徽、江西、湖南、广东、广西、福建、云南等地，同属植物还包括昆明山海棠(TripterygiumhypoglaucumHutch)、东北雷公藤(TripterygiumregeliiSpragueetTakeda)。雷公藤是一味传统中药，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗生育等活性[1]，这些作用是由其所含的二萜和三萜内酯、及生物碱等多种成分的协同作用所产生的[2]。雷公藤多苷是从卫矛科植物雷公藤根中提取出来的一些次代谢物的混合体,具有抗炎和免疫抑制作用，在临床上雷公藤多苷片广泛用于治疗类风湿性关节炎[3]，并在抗肿瘤方面具有良好的应用前景[4]，其抗生育活性也曾受到关注[5]。但是，雷公藤药材和制剂都有明显的毒副作用，临床安全使用的治疗剂量较小、治疗窗较窄，药材、分离制备工艺、服用剂量不合理等多种因素都会导致服药后的毒性反应[6]。尽管已有大量的雷公藤化学成分的分离鉴定研究和雷公藤内酯(雷公藤多苷)的药理研究报道[2,6~9]，但是临床上广泛使用的“雷公藤多苷”产品大都仅对所含的雷公藤内酯醇(雷公藤甲素)或雷公藤酯甲进行测定控制[10~12]，中药成方制剂标准[13-14]中分别以雷公藤酯甲与雷公藤内酯醇作为指标，使用薄层扫描法进行测定，控制指标准确性较差。其化学成分的整体系统分析控制研究和实际应用很少，仅见有对雷公藤叶提取物指纹图谱的报道[15]。中药指纹图谱是目前已被国内外广泛接受的一种天然药物质量评价模式，本文以“指纹对照品对照”[16]，分别采用夹角余弦法和相对欧氏距离法[17]从化学成分定性和定量两个方面对雷公藤药材及其制剂进行雷公藤内酯整体质量进行多指标化学成分分析控制，为雷公藤制剂质量的整体控制提供参考，以保障临床用药的安全。1仪器与试药Shimadzu2010高效液相色谱仪(日本岛津公司)，LCSolution色谱数据工作站(日本岛津公司)；Satorious电子分析天平(德国赛多利斯股份公司)；KQ3200E医用超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷和石油醚均为分析纯(南京化学试剂厂)；中性氧化铝(100~200目)；水为重蒸水。4雷公藤药材为TripterygiumwilfordiiHook.f.的干燥根及根茎，分别于2007～2008年购自广西、福建、四川、浙江、湖南等地，由南京师范大学生命科学院龚祝南教授鉴定(见表1)。雷公藤片剂：市售(见表2)。雷公藤内酯醇(批号111567-200502)、雷公藤酯甲(批号111597-200402)对照品分别购自中国药品生物制品检定所。表1雷公藤药材来源Tab.1OriginofTripterygiumwilfordiiHook.f.表2雷公藤多苷片来源Tab.2Originoftripterygiumtablets2溶液的制备2.1药材供试品溶液的制备取雷公藤药材粉末(过40目筛)约5.0g，精密称定，加无水乙醇100ml，浸泡过夜后水浴加热回流2h，慢速滤纸抽滤，用20ml无水乙醇分次洗涤残渣，合并滤液，将滤液于50℃水浴减压旋转蒸发至干，精密加入无水乙醇20ml复溶，定量移取15ml，置中性氧化铝柱[中性氧化铝5.0g，柱内径0.8～1.0cm，用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(1:4)5mL预洗]上，用石油醚-乙酸乙酯(1:4)50mL洗脱，收集洗脱液，于45℃水浴减压旋转蒸发至干，残留物精密加入1ml甲醇-水(80:20)溶解，用微孔滤膜(0.45µm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.2制剂供试品溶液的制备取雷公藤片剂10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取细粉约0.5g，精密称定，置25mL量瓶中，加无水乙醇约20mL，密塞，超声处理(120W，40kHz)60min，冷至室温，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液15mL，置中性氧化铝柱[中性氧化铝1.0g，柱内径0.8～1.0cm，用石油醚-乙酸乙酯(1:4)5mL预洗]上，用石油醚-乙酸乙酯(1:4)30mL洗脱，收集洗脱液，于45℃水浴减压旋转蒸发至干，后续步骤同“2.1”项。3指纹图谱的建立3.1色谱条件与系统适用性用PhenomenexLunaC18(4.6mm×250mm,5µm)色谱柱，甲醇(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱：0min(A40%)→120min(A70%)；流速1.05mL·min-1；检测波长218nm；柱温为35℃。在上述色谱条件下，雷公藤内酯醇色谱峰与相邻色谱峰分离度大于1.5。3.2测定方法精密量取供试品溶液20µL，注入色谱仪，记录色谱图。以雷公藤内酯醇的保留时间和峰面积为参比计算各指纹峰的相对保留时间(α)和相对峰面积(AR%)。按夹角余弦和相对欧氏距离法分别计算指纹图谱定性和定量相似度。3.3特征峰的确定分别测定各批雷公藤药材和制剂的HPLC指纹图谱，经比较分析后确定药材指纹共有峰32个，制剂共有峰30个。图1为雷公藤药材和制剂的典型HPLC指纹图谱和空白样品色谱图。选择主要特征有效成分雷公藤内酯醇峰为参照峰(s峰)。图1HPLC指纹图谱(A)雷公藤药材，(B)雷公藤片Fig.1HPLCFingerprintchromatogramsof(A)TripterygiumwilfordiiHook.f.and(B)tripterygiumtablets3.4方法验证在“2.1”项的条件下制备福建药材供试样品，在“2.2”项的条件下制备上海复旦复华药业有限公司生产的雷公藤片剂(批号070302)为制剂供试样品。对同一供试品溶液，连续测定6次，考察精密度；对同一供试品溶液分别放置0，2，4，6，12，24h分别测定，考察稳定性；取同一批供试品，制备供试品溶液6份，分别测定，考察重复性。结果表明：以雷公藤内酯醇为参比，药材和制剂各指纹色谱峰的相对保留时间和相对峰面积重复性良好，RSD均小于5.0%，符合指纹图谱的要求。4特征成分含量测定4.1雷公藤内酯醇含量测定4.1.1对照品溶液的制备精密称取雷公藤内酯醇对照品适量，加甲醇溶解，制成每1mL含雷公藤内酯醇44µg的对照溶液。4.1.2线性关系精密称取雷公藤内酯醇对照品适量，少量甲醇溶解后用甲醇-水（80:20）定量逐级稀释配制成浓度分别为8，16，40，80，和160mg·L-1的系列标准溶液，在“3.1”项色谱条件下测定，以质量浓度(C，mg·L-1)为横坐标，以峰面积6(A)为纵坐标进行线性回归。结果表明，雷公藤内酯醇进样浓度在8~160mg·L-1范围内有良好的线性关系，回归方程为：A=4.304×104C+2.091×104r=0.9999。4.1.3回收率精密称取福建产地药材和南京军区南京总医院(批号060530)已测知雷公藤内酯醇含量的样品各9份，分别加入相当于样品中已知量80%，100%和120%的对照品溶液(44µg·mL-1)后分别照“2.1”项和“2.2”项下方法制备药材及制剂回收率测定用样品溶液，低、中、高浓度各3份，在“3.1”项色谱条件下测定，结果见表3。平均回收率及RSD均符合中药质量控制的要求。表3雷公藤内酯醇加样回收率结果Tab.3Theadditionrecoveryoftriptolide4.1.4样品测定分别按“2.1”项和“2.2”项下方法制备雷公藤药材(见图2)和雷公藤片剂(见图3)供试品溶液，在“3.1”项色谱条件下测定，以外标标准曲线法计算各