DNA分子标记用于中药鉴定

DNA分子标记鉴定分子生药学molecularpharmacognosy•在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学，所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法，是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。分子生药学研究内容研究内容鉴定方面生产方面获取有效成分方面DNA分子标记鉴别药材培育选种转基因器官培养技术DNA分子遗传标记•以形态学为主的生药鉴定方法(性状鉴别、显微鉴别)和理化鉴别，还不能解决所有生药的真实性鉴定问题，特别是对同属多来源生药及种内的一些变异(道地药材)、动物药等难以专属性地鉴定。•学科发展的需要以及分子生物学技术的飞速发展使DNA分子遗传标记（DNAmoleculargeneticmarker）鉴别生药应运而生。道地药材•道地药材的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，可用公式表示：•表现型phenotype=基因型genotype+环境饰变（environmentalmodification）•生药DNA分子遗传标记鉴定是指通过比较生药间DNA分子遗传多样性差异来鉴别生药基源，确定其学名的方法。DNA分子是由G、A、C、T四种碱基构成，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，这就是生物的遗传多样(geneticdiversity)。在DNA分子上，有编码与物种存活密切相关的基因区域、编码与物种存活不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。基因组DNA的这些不同区域在生物进化过程中所受到的选择压力不同，前者所受选择压力大，表现出高度保守，后者所受选择压力小，表现出较大的变异。•正是由于这种DNA分子不同区域承受的选择压力不同，使得DNA分子的不同区域有不同程度的遗传多样性。因此，我们能够选择适当的DNA分子遗传标记，在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象进行准确地鉴别。•下面对生药DNA分子遗传标记鉴定的相关技术和方法作一简单介绍。一、DNA提取技术•DNA的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。•总DNA的有效提取要求材料中的DNA尽可能少的降解。•从植物药材中提取DNA一般可分为两个阶段:•第一阶段是植物细胞破裂后释放出DNA。•第二阶段是DNA与其它细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离，在这个阶段，重要的是要保证大量的DNA不能混杂在细胞碎片中，DNA要与蛋白质和其它污染物完全分离，因为这些污染物的存在会干扰下一步的分析。•对于幼嫩器官的材料（鲜品或硅胶快速干燥样品），一般方法都可以得到质量符合要求的DNA。•但对于中药材，情况则要复杂得多，需要针对具体材料，设计去除含酚羟基的化合物和多糖类化合物的方法。•DNA的质量将直接关系到实验的成败。•一般而言，所得的DNA应完整、有足够的量，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型，此外，还应满足下游操作的要求，如用于PCR分析的DNA不应含干扰PCR反应的污染物。二、琼脂糖凝胶电泳技术•琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的常用方法，具有简便、快速的优点。•DNA琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动••DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，使分子大小和构象不同的DNA分子迁移率出现较大差异，从而达到分离目的。•在凝胶中加入少量溴化乙锭，其分子可插入DNA的碱基之间，因此可在紫外光灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置，并可在紫外光灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。三、PCR技术•聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术。•PCR技术能在一个离心管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，在EB染色及电泳后，肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。DNA复制特点1.PCR技术的基本原理•类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。•PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：•①模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮循环作准备；•②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；•③引物的延伸DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。2.参加PCR反应的物质•主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。•（1）引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。•（2）酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100μl时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。•（3）dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。•在PCR反应中，dNTP的浓度应为50～200μmol/L，尤其应注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低还会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。•（4）模板(靶基因)质量是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。•再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。•RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或酚/SDS法等，要防止RNase降解RNA。•（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。•Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。四、生药鉴定常用的DNA分子标记方法•DNA分子标记技术•⒈以传统的southern杂交为基础的分子标记技术RFLP限制性内切酶片段长度多态性•⒉以PCR为基础的分子标记技术⑴RAPD随机扩增多态性DNA⑵SCAR测序的扩增区段⑶STS测序的标记位点⑷DAFDNA扩增产物指纹分析•⒊以PCR和RFLP相结合的分子标记技术：AFLP扩增的限制性内切酶片段长度多态性•⒋以重复序列为基础的分子标记技术⑴Satellite:卫星DNA(重复单位为几百～几千碱基对)⑵Microsatellite:微卫星DNA(重复单位为2～5碱基对)⑶SSR：短重复序列（一）限制性片段长度多态（restrictionfragmentlengthpolymorphism，简称RFLP）生物在进化过程中，由于种种原因引起的基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，在一处或几处发生某种差异，当这种改变（即使是很小的改变）涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，即限制性酶谱的条带方式将出现不同，产生多态性，称为限制性片段长度多态。•一般应用Southern杂交检测这种多态性，将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜（或其它膜）上，然后再用标记的克隆基因作探针进行杂交，经放射自显影后即可在X光片上看到DNA多态性了。•该方法试验步骤繁琐（包括Southern转移、探针标记、杂交、检测等），又受到探针来源的限制，所需DNA样品量大（因没有对DNA进行扩增），仅适于DNA未明显降解的新鲜材料。（二）随机扩增多态性DNA(RAPD)（randomamplifiedpolymorphicDNA）和任意引物PCR(AP-PCR)（arbitraryprimerPCR）•RAPD（randomamplifiedpolymorphicDNA）是1990年美国杜邦公司科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。Williams称之为RAPD，Welsh称之为AP-PCR。•RAPD技术建立在PCR技术基础上，它是以任意序列的寡核苷酸单链(通常为10个碱基，AP-PCR则为20～30个碱基)为引物，对所研究的基因组DNA进行随机扩增。•RAPD所用的一系列引物的DNA序列各不相同，但对于任一引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点。•这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增的反应条件，即在一定范围内模板DNA上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范围的DNA片段。•在不同物种基因组DNA中，这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点分布发生相应的变化，而使PCR扩增产物增加、减少或发生分子量的变化。通过对PCR产物的检测和比较，即可识别这些物种基因组DNA的多态片段。•与常规PCR相比，RAPD主要有以下特点：①无需专门设计RAPD扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9～10个寡核苷酸。②每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。③退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。④较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。•该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物、微生物物种及中药材的鉴定等各个领域。在生药鉴定方面，该方法在人参及其伪品、甘草、黄连、冬虫夏草及其伪品、贝母等药材的鉴定中有应用。（三）扩增片段长度多态性标记（amplifiedfragmentlengthpolymorphicDNAmarker，AFLP）•AFLP标记是RFLP与RAPD相结合的产物，是1992年由荷兰Keygene公司科学家VosPieter等发明并发展起来的一种选择性扩增限制性酶切片段的方法。AFLP检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间DNA序列的插入与缺失，本质上与RFLP一致。•AFLP的优越性：①AFLP可在不知基因组DNA序列情况下构建其指纹图谱。②AFLP所需DNA用量少。③AFLP反应灵敏、快速高效。④AFLP指纹图谱多态性丰富，可用来检测种和种以下水平的差异。⑤AFLP标记呈典型的孟德尔遗传，能检测到整个基因组的遗传变异。⑥AFLP对反映条件的变化如模板浓度变化等不灵敏，重复性好。⑦AFLP采用的是与接头序列和限制性内切酶位点同源的特异引物，且采用了较高的退火温度，特异性较高。•正是由于该技术具有以上优点，在遗传多样性、基因追踪及定位、分类与进化、系统发育、品种鉴定等