GCMS方法检测全血中15种农药残留

LOGOGC/MS方法检测全血中15种农药残留研究背景大量研究表明，农药在大量使用后会在环境中存在一定的残留，农药的化学性质和使用量不同，残留的量也不同。在国内外研究中，关于农药在生物样本中的残留主要集中在有机氯、有机磷、拟除虫菊酯类和除草剂四大类。在我国急性和慢性中毒时有发生，为确定突发化学中毒事件的性质，需要我国人群除草剂残留量的背景值作为定性的参考依据。因此，作为国家科技支撑计划课题(2006BAI06B02)的一部分，为下一步建立常用除草剂人群残留量的参比值和全国范围的具有代表性的生物样品库提供技术支持和可靠数据。该方法较目前常用方法灵敏度有很大提高，适用于血液中农药含量较低的样品检测。应用范围人血液中15种常用农药的样品提取方法和GC/MS定性、定量检测方法。有机磷农药•甲拌磷、二嗪农、阿特拉津、乐果、甲基对硫磷、马拉硫磷有机氯农药•氯丹、a-硫丹、b-硫丹拟除虫菊酯类农药•联苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯除草剂•2,4-D丁酯、扑草净、丁草胺试剂甲醇、二氯甲烷15种农药标准品（甲拌磷、二嗪农、阿特拉津、乐果、2,4-D丁酯、扑草净、马拉硫磷、甲基对硫磷、丁草胺、氯丹、α-硫丹、β-硫丹、联苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯）保护剂古洛糖酸内酯（sigma试剂公司99.75%）仪器Angilent6890-5973气相色谱-质谱联用仪色谱柱DB-35MS（30m×0.25mm×0.25μm）浓缩仪（氮气吹干）涡旋振荡器（转速可调节）超声仪离心机标准保护剂溶液的配置准确称取100mg古洛糖酸内酯，用甲醇定容稀释至50ml容量瓶中，轻轻震荡混匀，即配制成浓度为2mg/ml的保护剂溶液；-4℃低温保存。根据各化合物的灵敏度不同，使用保护剂溶液配置标准溶液和标准系列，各化合物浓度水平(μg/L)如下：丁酯102050100200甲基对硫磷102050100200氯丹102050100200甲氰菊酯102050100200三氟氯氰菊酯102050100200根据各化合物的灵敏度不同，使用保护剂溶液配置标准溶液和标准系列，各化合物浓度水平(μg/L)如下：涡旋震荡、超声提取冷冻破乳、离心分层氮吹浓缩、微量定容移除浓缩液，供仪器检测样品预处理方法样品预处理（1）涡旋震荡、超声提取将加有1.5ml全血的螺口具塞15ml试管中，缓慢加入6ml二氯甲烷。在涡旋振荡器上涡旋振荡5min（即使发生乳化现象，仍要继续震荡），转速以液面不接触到试管塞为准。放入清洗超声仪中超声辅助提取20min。样品预处理（2）冷冻破乳、离心分层将超声后的试管放入-20℃以下的冰箱中冷冻20-30min。冷冻后取出放置至完全融化后，用高速离心机以3000rpm离心15min，至完全分为三层。将上层液体倒入废液池内，用一只未使用过的空白吸管将中间层固体（沉淀蛋白）轻轻挤压到试管一侧，然后将下层提取液全部转移至另一支洁净普通玻璃试管中。注：转移过程中一定要缓慢，以免将其他杂质一同倒入试管中。样品处理（3）氮吹浓缩、微量定容将存有提取液的试管在浓缩仪上吹至近干后，用150μl甲醇保护剂溶液溶解，最大转速涡旋振荡2min，移入含有250μl内插管的进样小瓶中，供气相色谱-质谱联用仪检测。在氮吹浓缩的过程中要注意氮气的流速不能太快，以免导致目标化合物的丢失，但也不宜太慢，会浪费时间。浓缩过程中温度控制在50℃，吹干时间控制在10min。色谱、质谱条件色谱、质谱条件仪器检测方法Text进样量进样方式溶剂延迟离子源温度四级杆温度载气进样口温度色谱程序色谱柱Tet电离电压扫描模式色谱条件色谱柱：DB-35MS（30m×0.25mm×0.25μm）；载气：高纯氦气，流速1ml/min；进样口温度：280℃；色谱程序：120℃（保持1.00min）20℃/min240℃（保持0.00min）10℃/min280℃（保持4.00min）20℃/min320℃（保持6.00min）共23min。进样量：1μl；进样方式：脉冲不分流进样/不分流进样；质谱条件电离电压：70eV；溶剂延迟：6.5min；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；、231二嗪农179179、304阿特拉津200200、215乐果125125、2292,4-D丁酯276276、162扑草净241241、184甲基对硫磷109109、125、127丁草胺176176、160氯丹375375、373α-硫丹241241、265β-硫丹241241、265联苯菊酯181181、166甲氰菊酯181181、265三氟氯氰菊酯181181、208方法的线性关系、检出限、定量下限2方法的准确度、精密度提取方法的确定固相萃取AgilentC18：2,4-D丁酯和联苯菊酯回收率较低OasisHLBC18固相萃取小柱氨基柱苯基柱氧化铝柱提取方法的确定液液提取正己烷乙酸乙酯正己烷-乙酸乙酯正己烷-乙腈二氯甲烷：提取回收率效果较好，且只需要一次提取，就能满足回收率要求，只是毒性较大，操作时需谨慎。保护剂的使用在采用GC和GC-MS对不同样品进行农药残留检测分析时，经常会发现有些待分析物灵敏度较低，或是峰型很差，拖尾严重，积分结果偏差较大。这些现象可能是由待分析物在进样口的高温环境中降解产生，或是待分析物在进样系统的活性位点滞留引起的向毛细管移动减慢导致的。保护剂的作用根据相关参考文献，对保护剂用于补偿基质效应进行了研究，认为古洛糖酸内酯(Gulonicacidγ-lactone)具有良好的补偿作用。适量的古洛糖酸内酯对农药有较好的保护作用，能够有效地补偿因系统中存在的活性位点引起的基质干扰效应，明显改善峰型，提高灵敏度和定量的准确性。超声提取方法的确定在采用液液提取时，加入有机溶剂后，在涡旋混匀过程中会发生严重的乳化现象，涡旋振荡提取回收率普遍较低，溶剂回收体积也只能达到加入量的1/2，通过实验发现，涡旋震荡发生乳化后，再采用超声辅助提取可以明显提高回收率，但仍无法达到检测要求，主要是溶剂回收率低的问题仍然没有改善。要注意的是，在采取超声措施时，提取容器要使用具塞玻璃试管，最好是螺口耐有机溶剂的玻璃试管，因为玻璃试管可以有效传递超声能量，而且在超声过程中，产生的热量会导致容积蒸汽压增大，以至会冲出普通试管塞。冷冻破乳方法的应用在采用溶剂液液提取过程中，由于乳化现象的产生，会影响溶剂的回收量，例如加入6ml有机溶剂，高速离心后只能取出3ml，甚至更少。这会直接影响目标化合物的提取效率。根据相关文献和本次实验验证结果，采用低温冷冻的方法，可以有效破除乳化现象，提高离心后提取溶剂的回收量，从而可以有效提高回收率。通过多次实验结果认为，在温度低于20℃持续冷冻大于20min时，溶剂回收效果较好。在本次实验中加入6ml提取溶剂回收量≥5ml。因此也提高了目标化合物的回收率。色谱柱的选择根据大多文献农药检测大多使用HP-5或DB-5的毛细管柱，但本次实验欲测定的化合物机极性范围较宽，而且其中含有极性较大、检测过程中较不稳定的有机磷类农药，在检测过程中这些化合物会有轻度拖尾现象。另外，样品中还含有大量的脂肪酸、油酸、胆固醇等非极性化合物，采用非极性柱或是极性较大的毛细管柱，分离效果都不理想。因此本次实验采用中等极性的DB-35的毛细管柱，是综合考虑各方面因素的决定的。结果证明分离效果比较理想。进样方式的选择进样方式不分流进样脉冲不分流进样为提高灵敏度，增加化合物的进样量，采用脉冲不分流进样，会得到较好效果。质谱扫描离子选择的原则（一）尽量选择主要离子碎片；（二）定量定性离子不能低于2个；（三）尽量避开基质成分中相同保留时间段上也存在的干扰离子；（四）尽量回避柱流失离子碎片。运行时间的确定对血液样品进行农药残留测定时，一定要注意，除了目标化合物以外其他化合物的保留时间，例如胆固醇的保留时间明显晚于待测化合物，如果第一次进样没有运行完全，将会在以后的进样中出现鬼峰，而且是保留时间不定，会影响定量。方法总结优点灵敏度较高、定量下限较低、操作简单、成本低应用范围较宽，包含常用的四大类15种常用农药，有利于中毒化合物的定性适用于低剂量中毒或是慢性中毒的预防和筛检作为国家科技支撑计划课题(2006BAI06B02)的一部分，为下一步建立常用农药人群残留量的参比值和全国