Hsp90表达上调与肺癌细胞化疗耐药的相关性研究

中国肺癌杂志2011年6月第14卷第6期ChinJLungCancer,June2011,Vol.14,No.6·472··基础研究·DOI:10.3779/j.issn.1009-3419.2011.06.02Hsp90表达上调与肺癌细胞化疗耐药的相关性研究刘婷王晓琨张黎川【摘要】背景与目的热休克蛋白（heatshockprotein,Hsp）90是Hsps家族中的重要成员，其高表达与肿瘤的发生、发展及化疗耐药密切相关。本研究旨在探讨替普瑞酮（geranylgeranylacetone,GGA）作用下人肺癌细胞SPCA-1及H446中Hsp90的表达水平变化及与肺癌细胞对顺铂化疗耐药的相关性。方法将细胞分成实验组与对照组，分别用含有不同浓度（0μM,10μM,50μM,100μM,500μM,1,000μM）的诱导剂GGA处理6h。采用免疫荧光细胞化学及West-ernblot方法检测各组细胞中Hsp90在蛋白水平的表达；应用MTT法测定细胞在化疗药物顺铂作用下生存率，并分析Hsp90的表达在两种肺癌细胞对顺铂耐药中的作用。结果SPCA-1及H446实验组细胞中Hsp90的表达水平均明显高于相应的对照组细胞，且与GGA具有一定的浓度依赖性。MTT显示两种实验组细胞对顺铂的生存率均明显高于相应的对照组细胞，亦呈一定的GGA浓度依赖性。结论GGA可以诱导人肺癌细胞SPCA-1及H446中的Hsp90的表达上调，且其表达水平都与GGA具有一定的浓度依赖性。Hsp90高表达的细胞对顺铂的生存率明显高于低表达的细胞，表明Hsp90的表达上调与肺癌细胞对顺铂的耐药有一定的相关性。【关键词】肺肿瘤；Hsp90；GGA；化疗耐药【中图分类号】R734.2TheCorrelationbetweentheUp-regulationofHsp90andDrugResistancetoCisplatininLungCancerCellLineTingLIU,XiaokunWANG,LichuanZHANGDepartmentofRespiratoryMedicine,theAffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,ChinaCorrespondingauthor:TingLIU,E-mail:[e-mail]【Abstract】BackgroundandobjectiveHsp90isamajormolecularchaperone,whichoverexpressionisinvolvedinoncogenesis,developmentanddrugresistanceinmanyhumancancers.TheaimofthisstudyistoinvestigatetherelationshipbetweentheGGA-inducedoverexpressionofHsp90andchemoresistancetoCisplatininSPCA-1andH446cellline.MethodsTheproteinexpressionsofHsp90inducedbyGGAatdifferentconcentrationswereanalyzedbyImmunofluorescenceandWesternblotting.CellssurvivaltoCisplatinwasdeterminedusingtheMTTassays.TheeffectofHsp90expressiononthedrugresistancetoCisplatinintwoCellLineswasanalyzed.ResultsComparedwiththerespectivecontrolcells,Hsp90expressionsinbothexperimentalcelllineswereup-regulatedobviously,exhibitingadose-dependentmannertoGGA.MTTassaysrevealedthattheIC50sofcisplatinalsoshowedasubstantialelevationfortheexperimentalcellsofSPCA-1andH446,andthiselevationwasalsoassociatedwithGGAconcerntration.ConclusionGGAiseffectivefortheinductionofHsp90intheSPCA-1andH446cellline.Up-regulatedHsp90isassociatedwiththechemoresistancetoCisplatininSPCA-1andH446cells.【Keywords】Lungneoplasms;Hsp90;GGA;Drugresistance1作者单位：116001大连，大连大学附属中山医院呼吸内科（通讯作者：刘婷，E-mail:[e-mail]）近年来，我国肺癌发病率逐年上升，分别占男性和女性恶性肿瘤的第一位和第二位，而化疗耐药是导致其治疗失败的主要原因之一。化疗的耐药性是多因素参与的过程，除了与肿瘤自身的基因类型有关外，还与肿瘤细胞所处的微环境密切相关[1]。肿瘤细胞在受到药物等不利因素刺激时，可诱导产生自身保护作用的热休克蛋白（heatshockprotein,Hsp）。Hsps与肿瘤耐药性关系的研究已引起学者广泛的关注。Hsps多以分子伴侣的形式参与细胞的损失与修复，其高表达可增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，并能引起细胞对化疗的耐药性增加[2]。Hsp90作为Hsps家族中拮抗细胞凋亡的主要蛋白，其众多底物蛋白参与了肿瘤细胞的生长调控及存活[3]，在促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡的信号转导过程中发挥重要作用。研究[4-6]表明Hsp90在肺癌、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤细胞中呈高表达状态，并且其持续高表达的肿瘤细胞能对紫·473·中国肺癌杂志2011年6月第14卷第6期ChinJLungCancer,June2011,Vol.14,No.6杉醇、顺铂和Doxorubicin等药物产生抗药性[7]，降低化疗的敏感性[8]。同样在白血病细胞中发现，高表达的Hsp90也参与肿瘤的耐药产生[9]。因此Hsp90已成为抗瘤治疗的研究热点。萜类物质替普瑞酮（geranylgeranylacetone,GGA）作为Hsp70的一种选择性诱导剂，同样可以诱导调节Hsps中其它成员的表达。有研究[10]报道GGA能够诱导胃粘膜细胞的Hsp90表达上调。顺铂是肺癌治疗的一线药物，顺铂的耐药是临床治疗中不可忽视的问题。目前关于Hsp90的表达与肺癌细胞对顺铂化疗耐药性的研究报道较少。因此，本研究旨在通过应用GGA诱导两种肺癌细胞系中的Hsp90表达，并分析其在两种细胞系中表达的不同及与肺癌细胞对顺铂耐药的相关性。1材料与方法1.1材料与细胞人肺腺癌标准细胞株SPCA-1及小细胞肺癌细胞株H446（均购自上海生科院细胞研究所的美国ATCC细胞），GGA、顺铂（Sigma公司），蛋白定量试剂盒、鼠抗人β-actin抗体（碧云天），FITC标记的羊抗小鼠抗体、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠IgG（北京中杉金桥），多克隆鼠抗、兔抗Hsp90抗体（美国Bioworld公司），RPMI-1640培养基（北京赛默飞化工）。1.2细胞培养及分组5%CO2、饱和湿度、37oC恒温孵箱，于含10%胎牛血清、青霉素100U/mL的RPMI-1640培养基培养SPCA-1及H446细胞，0.25%胰蛋白酶消化传代。取指数生长期的两种细胞各以5×104个/mL细胞分别接种于100mL的培养瓶中，长至80%融合时，弃去培养基，PBS液洗2次，待用。细胞随机分为实验组与对照组，参照文献[11]，实验组加入不同浓度GGA（10µM、50µM、100µM、500µM、1,000µM）；对照组加入PBS，培养6h。然后分别采用免疫细胞荧光化学和Westernblot检测两种细胞系各组细胞中Hsp90蛋白水平的表达。1.3免疫荧光细胞化学检测Hsp90蛋白水平的表达消化收集对数生长期两种细胞系细胞，于六孔板中的盖玻片上各以1×105/mL进行细胞爬片，细胞贴壁固定后，加适量培养基再培养24h后随机按实验组和对照组分别处理分组，PBS冲洗，用4%多聚甲醛固定各组细胞15min，用PBS冲洗3次后，0.2%Triton透膜15min、0.1%PBST冲洗2次，再用1%BSA封闭30min，分别加入一抗（多克隆鼠抗人Hsp90抗体1:200），4oC湿盒内过夜。PBS冲洗后，避光加入二抗（FITC标记的羊抗鼠抗体1:100），37oC杂交1h。最后PBS冲洗，滤纸吸干后封片。在激光共聚焦488nm处观察各组细胞Hsp90出现的位置及强度变化。1.4Westernblot法检测Hsp90蛋白水平的表达消化收集两种细胞系的各培养瓶中细胞于1.5mLEp管中，加入含10μL/mL的蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液400μL，置冰上裂解30min，以12,000rpm、4oC离心15min，取上清转移至新管，重复离心2次，-70oC保存待测；BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，进行SDS-PAGE恒压100V电泳90min、恒流300mA湿式电转印2h。将转印的PVDF膜放入封闭液中4oC过夜，分别加入稀释的兔抗人Hsp90抗体（一抗，1:500）及鼠抗人β-actin（一抗，1:400），37oC孵育2h，PBST洗膜3次，每次5min。再加入稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔、羊抗鼠IgG（二抗，1:2,000），37oC孵育1h，PBST洗膜3次，每次5min，室温化学发光显色。凝胶成像系统对PVDF膜进行扫描分析，计算公式为：某样品Hsp90的相对表达水平=样品Hsp90的IOD值/样品β-actin的IOD值。1.5MTT法检测GGA诱导对细胞生存率的影响取对数生长期两种细胞系的各组细胞，分别以1×104个/孔的密度接种于96孔培养板，每孔加200μL培养基，置于5%CO2、饱和湿度的37oC孵箱培养24h。加入不同浓度的顺铂（0μM、2μM、4μM、6μM、8μM），每个浓度设3个孔，继续培养顺铂组48h后，再向各孔加入MTT20μL，4h后加入DMSO，酶标仪上选择波长490nm，检测各孔OD值，计算细胞生存率。细胞生存率=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。应用ModifiedKabermethod法求出细胞的半数抑制浓度（50%inhibitoryconcentriton,IC50），并求得耐药指数。耐药指数（resistanceindex,RI）=IC50实验组/IC50对照组。1.6统计学处理采用SPSS11.5统计软件，所有实验均重复3次以上，实验数据用Mean±SD表示，采用单因素方差分析比较组间差异，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Hsp90蛋白水平的表达采用免疫荧光化学的方法，比较实验组与对照组细胞Hsp90蛋白的表达。用FITC染色后，在488nm激发光的激发下，NIKONC1激光共聚焦显微镜下观察，在两种细胞系中均可见该蛋白主要分布于细胞核周围及胞浆中。与相对应的对照组相比，两种细胞系的各实验组细胞的荧光强度均随GGA浓度的增加呈中国肺癌杂志2011年6月第14卷第6期ChinJLungCancer,June2011,Vol.14,No.6·474·现明显增强趋势，Hsp90蛋白表达逐渐增加（图1）。为了进一步确定Hsp90的蛋白表达水平变化的差异，采用Westernblot杂交的方法来检测SPCA-1及H446各组细胞中Hsp90的相对表达量（图2，图3）。表1显示，SPCA-1细胞中，当GGA的浓度为10μM-1,000μM时，Hsp90蛋