分子生物学常用技术上

分子生物学常用技术PCR产物A-T克隆测序重组表达载体重组蛋白制备抗体转染细胞原核表达载体真核表达载体病毒表达载体昆虫表达载体酵母表达载体检测活性体内、体外作用机制应用(1)PCR(2)核酸的纯化：凝胶回收Kit(3)连接反应：16℃过夜/22℃2h(4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit(5)宿主菌的转化及蓝白筛选(6)挑克隆：2ml含抗生素的LB(7)提质粒：Kit(8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR(9)测序：生物技术服务公司(10)菌种保存:20~30%甘油-LB，-20/-70℃步骤：(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染(12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、NorthernBlot、原位杂交、SouthernBlot(13)目的蛋白表达的检测：原核表达：SDS-PAGE(重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB真核表达：WesternBlot、ELISA、免疫组化(14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag(15)制备抗体：多抗和单抗(16)基因功能检测：提高/降低表达水平细胞周期检测：流式细胞仪细胞增殖检测：MTT细胞凋亡检测:流式细胞仪、TUNEL、DNALadder抑瘤活性检测：体外、体内对血管化的影响。。。。。。。(17)作用机制1.PCR：Pfu,加A尾；[1208/8:00]2.Agarose电泳：Goldview染色;[1208]3.核酸纯化：凝胶回收Kit;[1208]4.Agarose电泳：检测回收条带;[1208]4.连接反应：pGMT,22℃2h;[1208]5.转化：Top10,热激法，蓝白筛选。[1208]实验一1.挑克隆：2ml含抗生素的LB+1个克隆；[1209/9:00]2.提质粒：Kit；[1210/8:00]3.重组质粒的鉴定：双酶切反应，37℃2h；[1210]4.Agarose电泳：Goldview染色；[1210]5.测序和序列比对：生物技术服务公司；[1213]6.菌种保存:20~30%甘油-LB，-20/-70℃。[1215]实验二实验三1.转化：BL21,热激法；[1208]2.挑克隆：2ml含抗生素的LB+1个克隆；[1209/9:00]3.转接：1%过夜菌+2ml含抗生素的LB,2管;[1210/8:00]4.诱导：0.5mM和0.1mM的IPTG（终浓度）;[1210]5.碎菌：超声处理;[1215/8:00]6.SDS-PAGE：10%分离胶，考兰染色，脱色。[1215]实验四1.SDS-PAGE：10%分离胶；[1215]2.转膜：湿转；[1215]3.封闭：RT1h；[1215]4.Ab1：4℃过夜；[1215]5.Ab2：RT40min；[1216/8:00]6.ECL：RT5min；[1216]实验XXX1.设备：加样器2.耗材3.试剂和配制方法：详细4.步骤：详细1.核酸的分离纯化和鉴定:基因组DNA、总RNA、质粒2.基因的克隆与鉴定方法3.外源基因转移技术和表达体系4.检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE分子杂交:SB、NB、WB、基因芯片技术DNA序列测定生物信息学分析技术5.基因功能研究的方法6.组学研究技术：基因组学、蛋白质组学内容’核酸的基本组成AlbrechtKossel1910年诺贝尔生理或医学奖揭示核酸的化学成分“其对蛋白质，包括核物质的研究工作为我们了解细胞化学作出了贡献”Lord(AlexanderR.)Todd核苷酸的基本结构1957年诺贝尔化学奖“核苷和核苷辅酶”1962年诺贝尔生理或医学奖FrancisHarryComptonCrickJamesDeweyWatsonMauriceHughFrederickWilkins“发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义”DNA分子的二级结构5’末端(游离磷酸基)3’末端(游离羟基)数量庞大dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)3’，5’-磷酸二酯键(共价键)直线形多聚体方向:5’---3’，5’CAG…..3’特点DNA半保留复制变性与复性变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂，不引起分子量降低。一、核酸的分离、纯化和鉴定1.基因组DNA的分离、纯化：PCR、Southern-blot、构建基因组文库实验材料：哺乳动物组织(50~100mg)哺乳动物细胞(5x105~107)六孔板/T25实验步骤：RT匀浆：TEpH8.0组织(液氮冻存、研磨)消化：EDTA、SDS、蛋白酶K、RNase、37℃/55℃抽提：酚、氯仿、异戊醇沉淀：异丙醇/NaAc+无水乙醇洗涤：75％乙醇干燥：风干溶解：TE/H2O注意事项：(1)试剂：pH值准确(2)蛋白酶K：20mg/ml，分装，-20℃，避免反复冻融(3)抽提：完全，不要触及蛋白层(4)干燥：避免过分(5)操作：小心，机械剪切作用，80~100kb2.总RNA的分离纯化:略3.质粒：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA分子。合格质粒的组成要素复制起始位点：原核1个，真核多个抗性基因多克隆位点启动子增强子终止信号加polyA信号第二步：筛选标记：如抗性，决定使用什么筛选标记：（1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr：可以阻止四环素进入细胞。（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor：氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活。（5）hygr：使潮霉素β失活。如何阅读质粒？第一步：质粒类型：Ori位置，原核/真核/穿梭质粒；第三步：多克隆位点，内切酶位点第四步：外源基因插入片段大小，＜10kb，大选大小找小第五步：表达系统元件：启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。克隆载体/表达载体碱裂解法收菌重悬：TE-葡萄糖裂解：变性，NaOH-SDS5min中和：复性，KAc抽提：酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)沉淀：异丙醇洗涤：70％乙醇溶解：TE-RNaseAKit:DNA介质(硅胶、玻璃奶)Omega：PlasmidMiniKitID6943-01？纯化：氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心聚乙二醇分级沉淀法4、核酸纯度的鉴定OD260和OD280应大于0.05OD260：DNA,RNA;OD280：蛋白质浓度：1OD260：50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA，总RNA35μg/ml单链RNA20μg/ml单链寡核苷酸纯度:OD260/OD280：蛋白质污染程度，DNA1.8，RNA1.7~2.1OD260/OD230：碳水化合物污染程度，2.0二、基因的克隆与鉴定方法1.基因的化学合成2.目的基因的克隆策略(1)根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因(2)根据表型变异克隆基因(3)基于图谱的基因克隆方法3.文库的构建与目的基因的克隆4.PCR反应与目的基因的克隆5.目的基因克隆的鉴别与分析1.基因的化学合成前提条件：已知基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列适用：分子量较小、价值极高的目的基因历史：1979年，Khorana等首次合成Ecoli酪氨酸tRNA基因方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法方式：固相合成法和自动合成法2.目的基因的克隆策略(1)根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因a.一个基因的序列已知：PCR技术，目的DNA片段b.一个基因的一段碱基序列已知：反向PCR/RACE，cDNA全长；探针：筛选cDNA文库，cDNA全长c.一个或多个物种的某种基因序列已知：同源性比较，保守序列，探针/引物，文库筛选/PCR，从新物种中分离功能相似的基因d.已知蛋白质的氨基酸序列：密码子的兼并性，可能的核苷酸序列，探针，筛选基因组/cDNA文库，基因序列(2)根据表型变异克隆基因：未知序列基因的克隆＃转座子示踪技术：又称转座子标签法，酵母和植物转座子DNA显性目的基因的纯合亲本隐性纯合亲本F1：理论上全部为目的基因编码的显性特征筛选因转座子插入而表现出隐性性状的个体构建基因组文库带有目的基因的阳性克隆探针：转座子DNA构建基因组文库转座子两侧的目的基因序列筛选编码显性特征的目的基因a.提总RNA:具有对比意义的两组，注意痕量DNA的污染b.反转录：得到细胞内所有基因的cDNA库下游引物：12组，T12MN(M:A、C、G;N:A、C、G、T)c.PCR扩增：32P，35S上游引物：24~26组，10mer下游引物：同反转录共计288～312种PCR反应＃mRNA差异显示：DD-PCR，1992，只能分离与某种处理或特征有关的基因步骤：d.电泳：测序胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶，放射自显影e.克隆：PCR差异带的回收、扩增和克隆f.Northernblotting鉴定：排除假阳性g.序列分析：Blast，递交新序列h.全长基因：RACE或筛选cDNA文库i.基因功能研究：生物信息学扩增条件：前1~4个循环采用不严格扩增条件(降低退火温度，增加引物与Mg2+浓度)，促使引物与模板的错配；后续PCR循环则采用严格的扩增条件。基因片段的开放读框氨基酸序列的功能结构域分析注意：a.与常规PCR不同，该方法可以保持样品中不同模板的相对比例;b.由于某一刺激因素常常影响数十、甚至数百基因的表达变化，但并不是每个基因的表达变化在此过程都起着重要的作用;c.电泳显示的单一扩增带并不表明它只含有单一的基因。优点：操作简单、敏感、快速、重复性好、要求的起始RNA量少、可同时检测某因素作用下表达升高与降低的基因。缺点：大规模地筛选，假阳性率高，得到的多为短片段，且都靠近3´端发展：EDD、ODD、GDD、LDD、FDD(增强、有序、基因组、长程、荧光)＃消减杂交：又称扣除杂交，克隆差异表达的基因(3)基于图谱的基因克隆方法：依赖于遗传图谱和物理图谱，可以用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因。方法：染色体跳查：速度快，200kb片段染色体步查：40kb片段举例：囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)---囊性纤维化(常隐)亨廷顿病基因(HD)---亨廷顿病(常显)肌营养不良基因(MD)---肌营养不良症(X隐)3.文库的构建与目的基因的克隆分类：按组成基因文库的重组DNA片段的供体来源分为两类cDNA文库：重组DNA片段来源于细胞表达出的mRNA，用于某类特定细胞中基因组的表达状态以及表达基因的功能鉴定的研究。基因组文库：重组片段供体是某种特定生物个体的基因组DNA，主要用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、基因在染色体上的定位、基因组中基因的结构和组织形式分析等方面的研究。基因文库：指采用体外克隆技术得到的一个重组DNA分子群体。λ噬菌体载体系统：最早使用，装载容量大，适合于全长cDNA克隆，易于长期保存，可采用的文库筛选的方法有限。质粒载体系统：体外操作简便，载体的可塑性强，可进行功能性筛选，插入片段的载体容量小，含有长片段的重组克隆易丢失，保存条件严格。噬菌体载体系统：可进行功能性筛选哺乳类细胞表达载体：反转录病毒载体是最常用的系统类型：表达型：采用表达型载体，插入的cDNA片段可表达成融合蛋白，具有抗原或生物学活性，可用抗体或某种化合物作为探针进行筛选。非表达型：只能用核酸探针筛选包含目的基因的克隆。(1)cDNA文库步骤：cDNA合成，连接到质粒/噬菌体载体上，转化或感染大肠杆菌，产生cDNA文库。cDNA=copyDNAcDNA文库的筛选：a.基于核酸相互杂交分离目的基因同源探针：mRNA差异显示利用种属间基因同源性，从EST数据库中搜寻兼并性寡核苷酸探针cDNA探针b.基于基因编码蛋白的检测筛选cDNA表达文库噬菌体表面展示系统酵