生化101-05--菠萝蛋白酶

菠萝蛋白酶的提取与活力测定班级：生化101菠萝蛋白酶的概述菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000，等电点为9.55。品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。产品已被广泛应用于食品、医药等行业。1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面团中，可使面筋降解，生面团被软化后易于加工。并能提高饼干与面包的口感与品质。2、干酪：用于干酪素的凝结。3、肉类的嫩化：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质的大分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨基酸和蛋白质。可广泛地应用于肉制品的精加工。一、菠萝蛋白酶在食品加工业的应用二、菠萝蛋白酶在医药、保健品业的应用•1、抑制肿瘤细胞的生长•2、对心血管疾病的防治•3、用于烧伤脱痂•4、消炎作用菠萝蛋白酶的作用条件•最佳温度：53±1℃•失活温度：≥65℃•最佳PH值：5.0～8.0•失活PH值：小于3.0和大与9.5•推荐用量:0.05～0.1%对蛋白质计•温度范围：50～60℃•作用PH值:6.0～9.0三、实验材料和试剂1、实验材料新鲜菠萝(下脚料）、0.1mg/ml牛血清蛋白2、实验试剂柠檬酸钠维生素C单宁0.1%EDTA溶液1.5%氯化钠溶液1%酪蛋白溶液1mol/L氢氧化钠溶液0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0）激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）四、实验器材和仪器1、榨汁机；2、离心机；3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；4、恒温水浴锅（37℃）；5、试管、试管架；6、烧杯、容量瓶；7、移液管；实验原理•蛋白质与单宁作用可以发生沉淀反应,形成单宁—菠萝蛋白酶复合物，所以可以用单宁提取菠萝酶。五、实验操作方法法和步骤（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶操作步骤：将下脚料切碎加柠檬酸钠，榨汁菠萝汁纱布过滤澄清液2000r/min，7min离心上清液沉淀物酶复合物酶复合物沉淀（蛋白糊酶）加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液4200r/min,5min离心加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心冻存备用超滤浓缩在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0.2%沉淀蛋白的效果最好,同时果汁的总酸度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀率达到72%。菠萝蛋白酶提取时,pH值为6.5～8.5左右,温度为60℃,菠萝蛋白酶的活性最强,可作为最佳提取条件。菠萝蛋白酶活力的测定主值空白值底物溶液（35℃）酶溶液（35℃）2.5ml2.5ml2.5ml——混合，在35℃精确保温10min，加蛋白质凝固剂酶溶液5.0ml——5.0ml2.5ml振摇，在水浴中继续静置30min，然后过滤；用分光光度计（275nm）以空白值为参比测定吸光度计算酶的比活性•酶的比活性•（F.I.P.-U/mg)=E275/(Ew×0.116×10）•E275——275nm处得吸光度•Ew——每2.5ml所用酶液中含酶的重量，mg•0.116——275nm处酪氨酸溶液（1umol酪氨酸/10ml）的吸光度•10——反应时间，min实验中的注意事项1.菠萝蛋白酶易受热失活，注意控制温度2.某些化学药品和金属离子易引起菠萝蛋白酶失活，生产过程忌碱、忌强酸作用，勿与铁、铜等重金属接触。3.菠萝蛋白酶是一种胶体，生产过程中易产生气泡造成损失，所以生产过程应注意操作。4.所加酪蛋白溶液的量对实验结果有影响。需要多次实验确定所加的量，避免反应不完全或蛋白剩余，影响实验结果。建议与改进•超滤法生产工艺和操作比较复杂，且设备一次性投资大。浓缩滤液若再用单宁沉淀法提取，可大大节约其他辅助原料的用量，总生产成本减少且产品质量好，纯度高，酶活力高，酶活总回收率高，经济效益明显较好。超滤法是指液体或气体混合物在外界压力驱动下通过一种在其上布满许多细微小孔（孔径在10～480埃可完全除去细菌类物质）的超滤膜获得不同分子量的澄清液或浓缩液的分离方法。工艺流程：菠萝下脚料→压榨→汁液→去杂质→澄清液→超滤浓缩→浓缩液→降温→加有机溶剂沉淀（95%乙醇）→湿酶→减压干燥→酶制品