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紫外-可见分光光度法在职业卫生检测中的应用姜素霞2013年10月熟悉紫外可见分光光度法相关基本概念熟悉紫外可见分光光度法的基本原理掌握紫外可见分光光度计的仪器组成、分析测试条件选择、分析方法及注意事项一.分光光度方法分类二.紫外-可见分光光度原理及仪器构成三.紫外-可见分光光度法分析条件的选择四.紫外-可见分光光度法的应用五.常见问题及注意事项光,或称电磁辐射,具有两重性质:(1)它是通过空间传播的一种波,具有波动性。(2)它又是由粒子(光子)组成的,具有粒子性。光子是非连续的(离散性的)能束。对包含大量数目的光子的行为,光的波动性是主要的;当对个别原子产生辐射效应时,把光子作为能束是主要的。一.分光光度方法分类光谱分区(穿透)能量小200nm400nm760nm大波长光谱区域紫外光区可见光区红外50μm分析方法紫外分光光度法可见分光光度法红外分光光度法紫、蓝、青、绿、黄、橙、红一.分光光度方法分类紫外分光光度法红外分光光度法分光光度吸光光度法发光光度法可见光分光光度法荧光分光光度法一.分光光度方法分类荧光分光光度计既可用于定量分析,也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。第一单色器选择激发光波长(>250nm的紫外光),故称为激发单色器。第二单色器(荧光单色器)与激发光入射方向垂直,并选择荧光波长,可提高方法的选择性和准确度。一.分光光度方法分类荧光分光光度法灵敏度高较紫外-可见分光光度法高1-3个数量级。选择性强能吸收光的物质并不一定能产生荧光,且不同物质由于结构不同,虽吸收同一波长的光,但产生的荧光波长也不尽相同。用样量少、操作简便缺点:许多物质本身不会发射荧光应用不够广泛受外界条件影响大铍:桑色素荧光分光光度硒:二氨基萘荧光分光光度一.分光光度方法分类荧光分光光度法特点物质吸收紫外和可见光区电磁波而产生吸收光谱——紫外-可见吸收光谱。波长(200~400)nm范围称为紫外光区,波长(400~760)nm称为可见光区。一.分光光度方法分类为什么可以达到检测的目的?产生吸收光谱的原因分子具有不同的特征能级,当分子从外界吸收能量后,就会发生相应的能级跃迁。同原子一样,分子吸收能量具有量子化特征,记录分子对电磁辐射的吸收程度与波长的关系就可以得到吸收光谱。一.分光光度方法分类紫外-可见吸收光谱法是一种分子光谱法。该法广泛运用于无机物质、有机物质定性和定量分析二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成分光光度法测量的理论依据:朗伯—比尔(Lambert-Beer)定律当溶液中的物质在光的照射和激发下,产生了对光吸收的效应。物质对光的吸收是有选择性的,各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。ε:比例常数,与吸光物质的性质、入射光波长及温度等有关。A:吸光度,表征物质对光吸收程度的量。C:溶液浓度;I0:入射光强;It:透射光强;b:液层厚度;T:透光率或透光度朗伯-比尔定律表达式二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成bcTTIIAtlg1lglg0当一束单色光穿过透明介质时,光强度的降低同吸收介质的厚度(或光径长度)、溶液的浓度成正比。I0Itb溶液的透光率愈大,表示它对光的吸收愈小溶液的透光率愈小,表示它对光的吸收愈大0IITt二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成摩尔吸光系数ε它是吸光物质在特定波长下的一个特征常数。在数值上等于1mol·L-1吸光物质在1cm光程中的吸光度。其单位为L·mol-1·cm-1。由于ε值与入射光波长有关,故表示ε时,应注明所用入射光波长。二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成朗伯-比尔定律A=-lgT=εbc适用于单色光、稀溶液回顾在分析化学中,ε值的大小反应了吸光物质对某一特定波长光吸光能力大小。ε值越大,该吸光物质的吸光能力越强。ε值是衡量光度分析方法灵敏度的重要指标,ε值越大,方法的灵敏度越高。二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成回顾五个单元组成光源单色器样品池检测器记录装置二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成吸收池讯号处理和显示器1.光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱,具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。钨灯或卤钨灯——可见光源(350~1000)nm氢灯或氘灯——紫外光源(200~360)nm二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成2.单色器是将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。包括5部分。①入射狭缝:光源的光由此进入单色器;②准光装置(准直镜):透镜或返射镜使入射光成为平行光束;③色散元件(分光镜):将复合光分解成单色光;过滤、棱镜或光栅;④聚焦装置:透镜或凹面反射镜,将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝;⑤出射狭缝:射出单色光。二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成3.样品室(吸收池)样品室放置各种类型的吸收池(比色皿)和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池,可见区一般用玻璃池。玻璃——能吸收紫外光,仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光,适用于紫外和可见光区二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成4.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号,常用的有光电池、光电管或光电倍增管、二极管阵列检测器。5.信号处理及显示记录系统即:记录装置。检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理等。二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成分光光度计从入射光类型划分单光束分光光度计简单,价廉,适于在给定波长处测量吸光度或透光度,一般不能作全波段光谱扫描,要求光源和检测器具有很高的稳定性。二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光,一束通过参比池,一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度,此比值即为试样的透射比,经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池,还能自动消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响,特别适合于结构分析。仪器复杂,价格较高。双波长分光光度计将不同波长的两束单色光(λ1、λ2)快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=1~2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。对于多组分混合物、混浊试样(如生物组织液)分析,以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下,利用双波长分光光度法,往往能提高方法的灵敏度和选择性。二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成紫外与可见分光光度计的不同首先光源不同,紫外用氢灯或氘灯,而可见用钨灯,因为二者发出的光的波长范围不同.从单色器来说,如果用棱镜做单色器,则紫外必须使用石英棱镜,可见则石英棱镜或玻璃棱镜均可使用,而光栅则二者均可使用,这主要是由于玻璃能吸收紫外光的缘故。从吸收池来看,紫外只能使用石英吸收池,而可见则玻璃、石英均可使用。从检测器来看,可见区一般使用氧化铯光电管,它适用的波长范围为(625-1000)nm,紫外用锑铯光电管,其波长范围为(200-625)nm.二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成紫外可见分光光度计主要部件包括光源、单色器、吸收池、检测器、讯号处理和显示器。紫外可见分光光度计光源、比色皿不同双光束分光光度计可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响,特别适合于结构分析。单色器通过使用“滤光片、棱镜、光栅、准直镜等将复合光分成单色光。二、紫外-可见吸光光度原理及仪器构成回顾GBZ/T210.4-2008职业卫生标准制定指南第4部分:工作场所空气中化学物质测定方法三、分光光度法分析条件的选择1.入射光波长的选择2.吸光度读数范围的选择3.参比溶液(空白溶液)的选择4.显色反应条件的选择5.狭缝宽度的选择6.溶液的酸度7.比色时间8.显色温度9.对标准曲线的要求10.对检出限的要求1、入射光波长的选择λmaxAmax此处:灵敏度高吸收曲线:吸光度随波长变化的曲线。不同的物质因其分子结构不同而具有不同的吸收曲线;同一物质,浓度不同,其吸收曲线的形状和λmax的位置不变,但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增大。三、分光光度法分析条件的选择KMnO4溶液的吸收曲线吸收曲线以入射光波长作横坐标,用分光光度计测量每一波长下物质对光的吸光度作纵坐标所绘制的曲线,称为吸收曲线。其作用是:选择入射光波长,在此波长下测量吸光度,则分析的灵敏度最高。因此,吸收曲线是吸光光度法中选择测定波长的重要依据。三、分光光度法分析条件的选择2、吸光度读数范围的选择A=0.2~0.8最适宜,误差小暗噪音——与检测器和放大电路不确切性有关,与光讯号无关讯号噪音——与光讯号有关仪器噪音(暗噪音、讯号噪音)三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择控制吸光度在合理范围的方法包括:控制溶液的浓度,如改变试样的称量,或改变溶液的稀释度等;选择不同厚度的比色皿,以改变光程的长度;采用示差法。三、分光光度法分析条件的选择3、参比溶液(空白溶液)的选择:目的:采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰(1)若仅待测物(M)与显色剂(R)的反应产物(MR)有吸收,可用蒸馏水作参比溶液。(2)若待测物(M)无吸收,而显色剂(R)或其它试剂(R′)有吸收,则用不加试样的空白溶液作参比溶液。(3)若试样中的其它组分有吸收(待测物M之外的组分,如N),但不与显色剂反应:当显色剂无吸收时,可用试样溶液作参比溶液;当显色剂有吸收时,可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂,以此溶液作参比溶液。总之,选择参比溶液的原则是:应使测得的试液的吸光度能真正反映待测物的浓度。三、分光光度法分析条件的选择参比溶液的选择方法参比溶液的使用方法样参调节光路光学性质和厚度相同样品池样品溶液,参比池空白溶液样品池参比池配制样品的溶剂空白溶液ATA%1000三、分光光度法分析条件的选择显色反应:将被测组分转变成有色化合物的化学反应被测组分中间生成物显色剂有色化合物++试剂显色剂有色化合物+显色剂:能与被测组分反应生成有色化合物的试剂4、显色反应条件的选择三、分光光度法分析条件的选择Fe2+NO反应生成物须在紫外-可见光区有较强吸光能力,即摩尔吸光系数较大。反应有较高的选择性,即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别。如显色剂(R)在测定波长处无吸收,即ε尽可能小。反应产物应足够稳定,反应产物组成恒定,以保证测量过程中溶液的吸光度不变。显色反应必须满足的条件三、分光光度法分析条件的选择5、狭缝宽度的选择以减少狭缝宽度时样品的吸光度不再增加为准,一般来说,狭缝宽度是样品吸收峰半宽度的十分之一。三、分光光度法分析条件的选择溶液的酸度对被测组分存在状态的影响(大多数被测金属离子易水解,当溶液pH增大时,可能生成各种类型的氢氧基配合物,甚至生成氢氧化物沉淀,使显色反应不能进行完全。)6、溶液的酸度对显色剂的平衡浓度和颜色的影响(影响显色反应的完全程度)溶液酸度对有色化合物组成的影响:(在不同pH的溶液中,显色剂与待测离子形成的有色化合物的组成往往不同,其颜色也不同)三、分光光度法分析条件的选择显色反应速率快:立即比色慢:溶液颜色稳定后(盐酸反应20分钟)7、比色时间样品或有色化合物稳定性稳定(SO2)不稳定(氮氧化物、氨等)三、分光光度法分析条件的选择有色化合物的稳定(高温分解)对光吸收的影响(标样和试样的显色温度一致)显色反应需要一定的温度(P2S5)显色反应的进行8、显色温度三、分光光度法分析条件的选择标准曲线:在(特定波长)、b固定的情况下,测定一系列不同浓度的标准溶液的吸光度,作A~c图,在相同条件下测定样品溶液的吸光度,从曲线上可查出被测样品的浓度。9、对标准曲线的要求浓度(c)A5个浓度点线性范围,相关系数三、分光光度法分析条件的选择0.5倍~2倍容许浓度浓度c负偏离吸光度曲线偏离的情况•依据B
本文标题:分光光度法在职业卫生检测中的应用
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