组培苗的培养

组培苗的培养生根培养初代培养继代培养组培苗生产中常见问题及控制组培苗的培养组培苗的培养一、培养含义将植物材料经培养，使之生长，分裂分化形成愈伤组织、芽、胚状体、原球茎，进一步分化成再生植株或产生代谢产物的过程。二、培养步骤植物组织培养初代培养继代培养生根培养•目的：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体、原球茎。•培养基：诱导或分化培养基。•培养基中CTK多，IAA少。•类型（根据发育方向）：•短枝发生型、丛生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型、原球茎的发生型1、初代培养初代培养微型扦插顶芽CTK刺激带芽的茎切段侧芽接种培养形成的茎梢节长，直立向上呈小灌木丛状获得较多嫩茎梢茎段培养继代扩繁试管苗生根培养无愈伤组织产生初代继代短枝发生型顶芽腋芽丛生芽发生型不定芽发生型Ⅰ脱分化分化愈伤组织芽、芽丛切割芽丛继代培养大量芽丛试管苗生根培养外植体初代继代不定芽发生型Ⅱ①②愈伤组织培养愈伤组织具分裂能力的细胞已分化细胞脱分化继代愈伤组织分裂诱导期分裂期分化期胚状体发生型菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察原球茎——指缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。原球茎发生型大花蕙兰原球茎增殖与植株再生目的：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽），扩繁无根苗（生产上边扩繁边生根）。扩繁方法：以几何级数增加，可切割茎段,分离芽丛、胚状体、原球茎。培养基：基本培养基或分化培养基实质：增殖培养物2、继代培养3、生根培养◆生根培养基：1／2或1／4MS基本培养基；不加或少加CTK，适量添加NAA；糖浓度1-1.5%。◆培养条件：增加光强，达3000-10000lx。◆目的：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。3、生根培养3、生根培养生根方法与途径①新梢基部浸入50或100ppmIBA液4－8h；②在含IAA类培养基中培养4－6d；③移入含IAA类的生根培养基培养。④生根困难的则在培养基中搭滤纸桥或按①生根方法与途径⑤延长在增殖培养时间⑥降低增殖倍率，减少CTK用量⑦对易生根植物，切割粗壮嫩枝在营养钵中直接生根⑧胚状体发育成小苗不经生根阶段，但需壮苗生根根、芽胚状体根、芽愈伤组织芽根芽外植体试管苗原球茎根、芽外植体成苗途径根三、组培苗生产中常见问题及控制1污染问题3玻璃化现象常见问题2褐变现象•1、污染原因•污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。•病原菌：细菌及真菌两大类。（一）污染问题2、污染特点•⑴细菌污染特点：菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。•污染途径：外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程•⑵真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。•污染途径：周围环境不清洁、超净工作台过滤装置失效、培养瓶的口径过大3、污染的预防措施•（1）防止材料带菌的措施•茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。•晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。•接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织。3、污染的预防措施•（2）外植体的灭菌•多次灭菌法，次氯酸钠-无菌水-次氯酸钠•多种药液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸钠-无菌水。•（3）器皿与金属器械的灭菌•玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌•金属器皿一般灼烧灭菌，也可干热灭菌3、污染的预防措施•（4）布质制品的灭菌：湿热灭菌•（5）无菌操作室的灭菌•2%新洁尔灭或70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。•（6）严格按照操作程序。褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。（二）褐变现象1、褐变的原因•⑴植物种类和品种某些植物酚类物质含量较多。•⑵外植体的生理状态幼年的材料培养含醌类物质较少。•⑶材料转移时间时间过长引起材料褐变。1、褐变的原因•⑷培养基的成分•过高的无机盐浓度•生长调节物质使用不当，BA过多•分生能力强的材料，氧化受抑制，褐变也被抑制•培养条件不适宜，温度过高或光照过强，褐变加速。2、褐变的防止措施•⑴选择适宜的外植体及最佳培养基。•⑵连续转移，诱导培养初期。•⑶加抗氧化物。•⑷加活性炭，0.1-0.5%活性炭。玻璃化是植物材料进行离体繁殖时，有些组培苗的嫩茎、叶片出现半透明状和水渍状的现象。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化是试管苗的生理失调症。（三）玻璃化现象1、玻璃化现象产生原因•⑴激素浓度高浓度的细胞分裂素会使玻璃化的发生比例提高。•⑵琼脂浓度琼脂浓度低，玻璃化苗增加。•⑶温度温度高易形成玻璃化苗。1、玻璃化现象产生原因•⑷光照光照偏弱易形成玻璃化苗。•⑸通风条件培养瓶容量小，气体交换不良，玻璃化苗多。•⑹离子水平植物种类不同，离子形态比例量要求不同。2、玻璃化现象预防措施•⑴控制无机营养成分，降低氮（铵态氮）和氯。•⑵提高蔗糖和琼脂浓度•⑶降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例。•⑷增加自然光照1000-1800lx，控制光照时间。•⑸控制温度，适当低温处理，避免过高的培养温度。•⑹使用透气性好的封口膜。•⑺培养基中加入间苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壮素。