7 第七讲 RNA的提取原理及提取技术

RNA的提取原理及提取技术RNA的分类:rRNA核糖体核糖核酸tRNA转移核糖核酸mRNA信使核糖核酸一个典型哺乳动物细胞含10-5ugRNA，其中rRNA占80%-85%（28S、18S和5S）tRNA占15%-20%mRNA占1%-5%mRNA是单链的，易受到核酸酶的攻击，而RNA核酸酶存在十分广泛且稳定，耐热，能适应较宽的PH范围。提取RNA过程中防止RNA酶污染所采取的措施：1所有的玻璃器皿在烘箱（186℃）中烘烤4-6h，不能高温灭菌的，用0.1%DEPC水溶液处理，再用洁净的蒸馏水冲洗；2所用的水先用0.1%DEPC37℃处理12h以上，再经过高压灭菌；3全部试验过程中戴手套、口罩操作，并经常更换；4RNA电泳槽用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥后，室温下用3%H2O2溶液浸泡10min，最后用0.1%DEPC处理过的水彻底冲洗；5工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离，最好是单独的操作空间。影响RNA提取的因素材料：切忌使用反复冻融的材料；如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存；如要多次提取，请分成多份保存；液氮长期保存，－70℃短期保存。影响RNA提取的因素样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解;酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁;动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻。注意：样品量适当，保证充分裂解。TRIzol：主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。影响RNA提取的因素纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；亲和层析法纯化。RNA提取方法异硫氰酸胍/苯酚法原理：异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将RNA释放到溶液中，采用酸性酚/氯仿混合液抽提，低pH值的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和DNA仍留在有机相，从而可以完成RNA的提取工作。操作步骤：1液氮研磨组织或细胞；2加入trizol试剂，进一步在保证RNA完整的情况下破碎细胞并溶解细胞成分；3加入氯仿抽提，离心分离水相和有机相，收集含有RNA的水相；4通过异丙醇沉淀，获得RNA样品。mRNA的提取分离纯化完整的mRNA是进行分子克隆、基因表达分析的基础。DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定1仪器测定紫外分光光度计ssDNA=33×（OD260－0D310)×稀释倍数dsDNA=50×（OD260－0D310)×稀释倍数ssRNA=40×（OD260－0D310)×稀释倍数核酸蛋白测定仪DNA纯度的判断A260/A280=1.8＞1.9表明有RNA污染＜1.6表明有蛋白质、苯酚等污染RNA纯度的判断A260/A2801.7—2.0＜1.7表明有蛋白质、苯酚的污染＞2.0表明有异硫氰酸胍残存2琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA电泳图谱RNA电泳图谱思考题：1提取RNA过程中防止RNA酶污染所采取的措施是什么？2如何根据A260/A280的值判断DNA和RNA的纯度？