02琼脂糖凝胶电泳

2020/2/41AgaroseGelElectrophoresis琼脂糖凝胶电泳2020/2/42Aftertheexperimentisfinished,studentsshouldknowhowtomakeanagarosegel.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。一、实验目的(ExperimentalPurpose)2020/2/43Gelelectrophoresis2020/2/44二、实验原理(ExperimentalPrinciple)•Electrophoresisisatechniqueusedtoseparateandsometimespurifyproteinsandnucleicacids,whichdifferinsize,chargeorconformationfromeachother.Electrophoresishasbecomethemostwidelyusedtechniquesinbiochemistryandmolecularbiology.电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分子构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一。2020/2/45•Agaroseisapolysaccharideextractedfromseaweed.Agarosegelshavealargerangeofseparation,butrelativelylowresolvingpower.Byvaryingtheconcentrationofagarose,fragmentsofDNAfromabout200to50,000bpcanbeseparatedusingstandardelectrophoretictechniques.琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000bp大小的DNA片断。琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。•Thehighertheagaroseconcentration,thestifferthegel.HigherconcentrationsofagarosehelpintheseparationofsmallDNAs,whilelowagaroseconcentrationsallowresolutionoflargerDNAs.2020/2/46Agaroseistypicallyusedatconcentrationsof0.5%to2%.ThedistanceDNAhasmigratedinthegelcanbejudgedbyvisuallymonitoringmigrationofthetrackingdyes.琼脂糖胶浓度一般在0.5％到2％之间。通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率最大。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Whenadequatemigrationhasoccured,DNAfragmentscanbevisualizedbystainingwithGelview.2020/2/47琼脂糖凝胶浓度0.3%0.6%0.9%1.2%1.5%2%DNA片段分离范围6-60kb1-20kb0.5-7kb0.4-6kb0.2-3kb0.1-2kb2020/2/48•Gelviewisafluorescentdye.Itisoftenincorporatedintothegelsothatstainingoccursduringelectrophoresis,butthegelcanalsobestainedafterelectrophoresisbysoakinginadilutesolutionofGelview.•TovisualizeDNAorRNA,thegelisplacedonaultraviolettransilluminator.Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview溶液中进行染色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。2020/2/49三、试剂与器材（Reagentsandapparatus）1.Agarose.2.TBE[5×stocksolution(1liter):54gTrisbase,27.5gboricacid,20ml0.5MEDTA,pH8.0].3.10×loadingbuffer:0.25%bromophenolblue,40%sucroseinwater.4.Equipment:beaker,graduatedcylinder,stirbar,microwave,Panbalance,comb,electrophoresistank,andElectro-phoresisSystem,Ultraviolettransilluminator.5.Gelview2020/2/410Ⅰ.Preparationofthegel（凝胶的制备）1.制备1％琼脂糖凝胶。称取0.5g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入50mL的0.5×TBE缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为1％琼脂糖凝胶液。（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）四、实验步骤(ExperimentalProcedures)2020/2/4112.制胶器的安装①取多功能制胶器，洗净，晾干；②将多功能制胶器放置于一水平位置，选择12×6cm制胶架，然后选择1.5mm18teeth的梳子（最大加样量25µl）；③将所选择规格的梳子插入制胶架的定位槽中。2020/2/4123.将熔化的琼脂糖凝胶液转入Gelview专用的三角瓶中，然后加入Gelview5µl。4.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入所选择的制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。5.待胶凝固后（30-60min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内。6.加入电泳缓冲液(0.5×)至电泳槽中。2020/2/413Ⅱ.LoadingDNAsamples(加样)用移液枪缓慢将DNA样品垂直加入加样孔直至开口下方。1.DNAsamples：10µl2.Loadingbuffer(6X)：2µl3.DNAmarkers：6µlTotal12µl2020/2/414Ⅲ.Gel（电泳）1.接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。保持电压60－80V。2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。2020/2/415Ⅳ.GelInterpretation（凝胶图像解释）•TheuncutDNAlanemayhaveseveralbandsinit.ThisoccursbecausethemobilityofplasmidDNAinanagarosegeldependsonitsmolecularconformationaswellasitssizeinbasepairs.PlasmidDNAcanexistinanyoneofthreemajorconformations:未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在：2020/2/416Supercoiled--plasmidisusuallyseenasasupercoilinabacterialcell.Thisformoftheplasmidwillmovethefastestthroughthegelduetoitscompactstructure.超螺旋——质粒在细菌细胞以超螺旋结构存在，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。2020/2/417Nicked--DuringplasmidDNAreplication,topoisomer-aseIintroducesanickintoonestrandoftheDNAhelixanduncoilstheplasmid.Physicalshearingandenzymaticcleavageduringplasmidisolationmayalsointroducenicksintothesupercoiledplasmidtoproducearelaxedopencircularstructure.切口——在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率介于超螺旋和线性DNA之间。2020/2/418Linear——LinearplasmidDNAoccurswhendamageresultsinstrandnicksdirectlyoppositeeachotherontheDNAhelix.Thisformistheslowestmigratingformofplasmid.ThepresenceoflinearDNAinaplasmidpreparationisasignofeithernucleasecontaminationorsloppylabprocedure.线性——当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率最慢，质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。2020/2/419五、实验结果(experimentalresults)1、DNA相对分子质量标准物（maker）2、pUC19质粒DNA经EcoRI完全酶解3、pUC19质粒DNA经EcoRI部分酶解4、自提的pUC19质粒DNA（此结果提得较好，为1条带，以超螺旋为主。）2020/2/420六、注意事项(Notes)ThemobilityoftheDNAdependsonthefollowingfactors：a.MolecularsizeofDNADNA的分子大小——分子量越小，迁移越快。b.Agaroseconcentration琼脂糖浓度——浓度越低，迁移越快。c.ConformationoftheDNADNA的构象——环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。d.Voltagepercmdistancebetweenelectrodes两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。2020/2/4214.Troubleshooting.（问题及原因）IftheDNAbandsarenotsharpanduniform,itmaybeduetothefollowingreasons如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：a.OverloadedDNADNA过载b.Voltagetoohigh电压过高c.Tornwell加样孔破损d.Bubbleingel凝胶中有气泡