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报告人：王浩丞2012年4月26日用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法主要内容•DNA-DNA杂交•16SrDNA在细菌分类鉴定的应用•几种“看家基因”（Housekeepinggenes）在细菌分类鉴定的应用DNA-DNA杂交现代细菌分类学中，DNA-DNA分子杂交一直认为是作为细菌分类和鉴定的“黄金法则”。基本原理：使用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外变性（高温或pH)，并在合适的条件下(盐类浓度和温度），使互补的碱基重新配对，测量杂交百分数(常以同源%表示；也有称碱基相似性%）百分数越高，杂交的两种DNA之间碱基线性序列的相似性就越高，说明它们之间的亲缘关系也就越近。常见的几种方法：（1）标记法（2）吸光度法（3）荧光强度法等DNA-DNA杂交核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株问的同源性程度。计算公式：结果的判定：一般认为核酸杂交同源性小于20％为不同菌属，20％～60％为属内紧密相关的种，60％～70％为同种内不同亚种，大于70％为同一亚种。DNA-DNA杂交16SrDNA在细菌分类鉴定的应用细菌核糖体的RNA含有3种类型，即23srRNA、16SrRNA和5SrRNA，它们含有的核苷酸分别约为2900个，1540个和120个。20世纪60年代末，Woese等学者开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16srRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。16srRNA和16srDNA的区别：16S中的S是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。rDNA和rRNA中的小写字母r是ribosome(核糖体)的缩写。rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列，也就是编码16SrRNA的基因。rRNA指的是rDNA的转录产物，它是构成核糖体的重要成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而成，其序列包含10个可变区（variableregion）和11个恒定区（constantregion），其中V1、V2、V3和V4共4个高变区，尤其是V2这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此，JohesSW和NellerHF等报道测定16SrDNA基因的部分序列即可达到鉴定的目的16SrRNA基因结构图第一，由于16SrDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。第二，16SrDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。16srRNA序列和DNA-DNA同源性相关关系的研究表明:序列的相性不在99.8%以上就不能达到70%以上DNA-DNA的同源性。16srRNA总共约有1500bp,0.2%的不同相当于3个碱基。由于数据库中的数据不一定完全而且个人读取数据也可能出现错读,因此由16srRNA序列鉴定种是很难的。16srRNA的同源性分析最适用于属及属以上的远缘关系。目前,已对2000种(约相当于50%)以上的真细菌的16srRNA进行了测序,不同菌属的16srRNA序列同源性为70%～95%,细菌核心基因（看家基因）虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别，但是无论多么小，它们必须包含有所有的信息去允许细菌去执行多种必要的功能，给予细胞维持内部的代谢平衡的能力，复制和进化，这三种主要的活细胞的功能。细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能蛋白，因此，它们必须去依赖它们自有的基因产物去执行不要的功能。1.信息的存储和加工DNA的代谢：（1）基本的复制功能（2）DNA的修复、限制和修饰RNA的代谢：（1）基本的转运功能（2）翻译（3）RNA的降解2蛋白质的加工、折叠、分泌3细胞的结构和细胞壁的加工4活跃且处于中间的代谢gyrB基因•gyrB基因是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码基因。在大多数细菌中，以单拷贝的形式存在细菌基因组的rnpA—rmpH—dnaA—dnaN—recF—gyrB—rnpA基因簇中。编码的是唯一一种能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶一DNA促旋酶的B亚单位蛋白GyrB。DNA促旋酶是一种细菌Ⅱ型拓扑异构酶，在DNA复制及DNA超螺旋结构的维持过程中起着重要的作用。（1）gyrB基因序列全长约为1．2—1．4kb，平均碱基替换率为每100万年变化0．7％~0．8％，比16SrDNA的每5000万年变化1％的速度快。（2）由于其作为蛋白编码基因，其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的第3位碱基，这就使得gyrB基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面，比非蛋白编码基因16SrDNA具有更高的分辨率。Kasai在对小单孢菌属(Micromonospora)15个有效描述的种和4个亚种的gyrB序列的研究中，得到了与基于16SrDNA序列相似的系统发育关系，但种内关系结果不同。经过与DNA—DNA杂交的比较分析，结果表明：基于gyrB序列的分类关系更符合DNA—DNA杂交结果。Daug在利用gyrB基因比较肠杆菌科(Enterobacteriaceae)不同属的系统进化关系时发现，与16SrRNA相比，gyrB序列比较适用于属内或属间关系的比较分析。•Soler等用gyrB和rpoD序列分析气单胞菌属(Aeromonas)的系统发育时发现，这2个基因具有相同的置换率(小于2％)和相似的变异位点(分别为34％•和32％)，分别用gyrB、rpoD或结合这2个基因的序列分析的结果均与已有分类结果一致。在种内水平上，gyrB对相近的种具有很高的分辨率，rpoD能把混杂在一起的种区分开来，综合这2个基因的序列分析能更好地区分相近的分类单元。Wang等对枯草芽孢杆菌属的16SrRNA基因、gyrB基因序列和DNA–DNAhybridization比较发现，gyrB基因序列的相似性在75.4%~95%之间，而且结果与DNA–DNAhybridization的一致性很高。rpoB:核糖核酸聚合酶是在所有的生物体内在转录以及最终的目标是控制基因表达的调控路径。rpoB基因编码五个亚单位中的一种，β亚单位基因所编码的。rpoB基因已经用于在临床微生物中的细菌的分子鉴定,它是细菌的一个核心基因。其可变区域位于2300bp到3300bp之间，sodA基因,其具有锰的金属依赖性依赖。超氧化物歧化酶歧化酶（编码超氧化物歧化酶,超氧化物歧化酶可以催化超氧阴离子的歧化反应产生氧分子和过氧化氢。groEL:编码一种热休克蛋白60Kda。recN:编码一个重组修复蛋白多种看家基因的用于进化分析的比较16Srrna：1468~1478bpsodA:435bprpoB:680BPgyrB；458bpgroEL:757bpPartialsequencecomparisonoftherpoB,sodA,groELandgyrBgeneswithinthegenusStreptococcusPartialrecNgenesequencing:anewtoolforidentificationandphylogenywithinthegenusStreptococcusOlgaO.Glazunova,DidierRaoultandVe´roniqueRoux研究了65株链球菌（其中有58个种和9个亚种）在不同种的细菌类型中，16SrRNA的基因序列的相似性是88.8%到99.7%之间，sodA基因的序列相似性是63.6%到100%，ropB序列的相似性是在76.1%到97.6%之间。gyrB基因序列的相似性是在64.6%到97.5%之间，groEL的序列相似性是在72.6%到96.6%。recN基因序列的相似性是从56.4%到98.2%之间16SrRNA序列相似性在两种亚种之间是从97.6%到99.9%。sodA基因的序列相似性是88%到98.9%，ropB序列的相似性是在97.95到99.6%之间。gyrB基因序列的相似性是在93.7%到98.5%之间，groEL的序列相似性是在93.9%到98.8%。recN基因序列的相似性是从98%到89.8%之间.NucleotidesequencesimilaritiesbetweenspeciesanddivergencebetweensubspeciesofthegenusStreptococcusrecNrepresentsthebesttooltoidentifystreptococciandtostudyevolutioninthisgroupofbacteria。系统发育分析和分子鉴定不用当仅仅基于一个所推荐的基因因为可能的基因复制、侧面基因的转移或者缺失，可能导致错误的结果，16Srna的基因的部分测序时细菌种类鉴定的第一步，它能够从属的水平和新种类的识别中鉴定出分离株和已公认的菌株(Stackebrandtetal，2002）谢谢大家！