中药、天然药物免疫毒性研究技术指导原则(第二稿)

1指导原则编号中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光敏性）研究的技术指导原则（第二稿）二00三年十二月十七日【Z】GPT4-12目录[概述]…………………………………………………………………4一、定义和意义……………………………………………………4二、背景和目的……………………………………………………4三、适应范围………………………………………………………4四、重点内容………………………………………………………6[基本内容]…………………………………………………………...6一、基本原则…………………………………………………………6二、免疫毒性…………………………………………………………6（一）适用范围和评价指标…………………………………………7（二）试验中应考虑的问题…………………………………………8三、超敏反应…………………………………………………………9（一）试验中应考虑的问题…………………………………………9（二）I型超敏反应………………………………………………….101．定义………………………………………………………………...102．主动皮肤过敏试验…………………………………………………103．主动全身过敏试验…………………………………………………104．被动皮肤过敏试验…………………………………………………115．抗体滴度检测………………………………………………………11（三）II、Ⅲ型变态反应………………………………………………12（四）Ⅳ型变态反应………………………………………………...12四、光敏试验…………………………………………………………..12（一）皮肤光变态反应试验……………………………………………13（三）光变态反应试验中应考虑的问题………………………………13五、数据分析及评价……………………………………………………143六、常见问题及处理…………………………………………………..15七、不同剂型的中药、天然药物的一般要求………………………..17[参考文献]……………………………………………………………18[附录]…………………………………………………………………19一、主动皮肤过敏试验………………………………………………19二、主动全身过敏试验………………………………………………21三、被动全身过敏试验………………………………………………22四、Ⅲ型超敏试验……………………………………………………23五、Ⅳ型超敏试验……………………………………………………24（一）Buehler分析和豚鼠最大值法………………………………….24（二）啮齿类局部淋巴结试验………………………………………..25（三）小鼠迟发型变态反应试验……………………………………..26六、皮肤光变态反应试验……………………………………………27[起草说明]……………………………………………………………27[著者]…………………………………………………………………304[概述]一、定义和意义免疫毒理学是毒理学中一门重要的分支学科，其目的是探讨外源性化合物对机体（人和实验动物）免疫系统产生的不良影响及机理。外源性化合物对机体免疫系统的损伤作用包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反应性过度增强，而导致机体过敏反应（变态反应）和自身免疫性疾病。过敏反应又称变态反应，是指机体受同一抗原再次刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应。按抗原与抗体或细胞反应的方式和补体是否参加等，将变态反应分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四型。其中Ⅰ型变态反应是了解得最多的一种变态反应，目前采用的过敏试验方法多数是根据Ⅰ型变态反应发病机制的不同环节而设计建立的。光敏反应包括光毒反应和光过敏反应（光变态反应）两类，光过敏反应为IV型变态反应的特殊类型，是局部给药和全身给药后，分布在皮肤中的药物中所含的感光物质与光线产生复合作用使得用药后皮肤对光线产生的不良反应。中药、天然药物为一种外源性物质，也可作为变应原引机体产生发变态反应。本指导原则仅就中药、天然药物对机体变态反应和光敏反应进行讨论。二、背景和目的从70年代后期开始，欧美等先进国家开始研究药物对机体免疫系统的毒性研究。90年代以来，逐渐将免疫毒性作为药物安全性评价的一项重要内容。随着中药走向世界，许多高新技术也广泛应用于中药新药的研发过程。其研究内容也日趋与国外化药新药研究接轨。中药作为一种外源性化学物质，进入机体后，同样对机体免疫系统产5生不同程度的毒副作用。在中药新药研究过程中，研究其对机体免疫系统的影响及机理，是中药临床前安全性研究及评价的一项重要内容。以往中药新药的安全性研究中，很少关注或检查免疫系统，故也极少发现受试物的免疫毒性作用。因免疫系统方面的功能改变能在某种意义上预示药物的不良反应，且免疫系统对毒物具有很高的敏感性。因此，需在新药评价过程中，逐渐建立一套评价方法，在常规的安全性研究中探索并发现药物的免疫毒性以及及引起的免疫系统的功能性改变等。传统观念认为，中药平和、安全，但近年来，伴随中药及其新制剂的不断增多，如注射剂品种的不断增加，使用范围的日益扩大，由中药引起的不良反应特别是变态反应也在逐年增多。以下几方面可能是导致中药变态反应发生的主要原因：（1）中药自身的特点：中药成分复杂，按生理活性可分为有效成分、辅助成分、无效成分、组织物及杂质等，其中不乏有导致机体的过敏物质，如动、植物蛋白，多肽，多糖等大分子物质，它们同时具有免疫原性和反应原性,属于完全抗原，可直接刺激机体免疫系统产生免疫应答,使机体产生抗体或致敏淋巴细胞,最后导致变态反应；一些小分子化学物质属于半抗原，进入人体后与蛋白质结合成全抗原而致敏。（2）中药及其制剂中的致敏原，除药物本身成分外，其制剂中的添加剂、助溶剂、稳定剂、着色剂、稀释剂及在制备过程中产生的杂质和药物本身的氧化、还原、分解、聚合等形成的杂质均能成为过敏原而致机体过敏，从而诱发各种类型的变态反应。（3）中药复方制剂：复方制剂包含多种不同药物，混在一起制成煎剂、注射剂、丸剂及外用制剂等。各种药物成分在体外就有可能发生相互作用,进入体内后在消化、吸收及体内转化过程中,也会有互相作用发生,这无疑也会成为发生不良反应的原因。鉴于此，中药免疫毒性特别是变态反应的研究是不可忽视的临床前安全性评价的重要内容之一。6三、适用范围该技术指导原则适用于拟用人和/或已上市的中药、天然药物的免疫毒性研究。这些药物指非口服给药途径的中药、天然药物，包括中药注射剂及其他局部用药的制剂。四、重点内容本技术指导原则的重点内容主要包括免疫毒性、变态反应试验和光敏试验的相关内容。[基本内容]一、基本原则免疫毒性研究过程必须执行《药品非临床研究质量管理规范》（GLP）。在进行试验设计中，应遵循随机、对照、重复的统计学原则。应在遵循安全性评价普遍规律的基础上，运用具体问题具体分析的方法，结合受试物的自身特点，充分考虑和结合药学、药效学、其他毒理学（长毒、急毒）及拟临床应用情况等信息，体现整体性、综合性的原则，在阐明其研究方法或手段科学、合理的前提下进行规范性试验，对试验结果应进行全面分析和综合评价，以达到免疫毒性研究的目的。二、免疫毒性药物对机体的免疫毒性常涉及免疫器官、免疫细胞和免疫分子。药物暴露后的免疫毒性可表现为淋巴细胞器官重量或组织学的改变，或骨髓及外周淋巴细胞的改变。药物对免疫系统影响的评价与免疫反应性有关，不能仅通过组织病理学和血液学的方法对淋巴组织进行单一检查，一般认为组织病理学变化通常不是敏感药物诱发免疫毒性的7指标，而仅见于相对较高的剂量时，且并不一定与功能性免疫改变相对应。因此，检测免疫毒性要通过多项指标来进行综合性评价。实验方法应建立在公认的免疫学理论和免疫实验技术基础之上；实验观察指标应标准、灵敏、系统、全面；通常由多剂量毒性实验、病理组织学和/或免疫组化方法完成。（一）、适用范围及评价指标需进行免疫毒性评价的受试物：由于免疫系统是一增生活跃的系统，因此对毒物非常敏感，但每一种化学物质都有其特定的靶器官，因此不必盲目地对所有受试物进行免疫毒性监测，而是选择性地对某些受试物特别是以免疫系统为靶器官的毒物进行研究。用于某些适应症的药物，因其作用机制的特殊性，对人体免疫系统可能产生影响，如感染HIV的病人，免疫系统已遭到严重损伤，故对用于AIDS的治疗剂进行免疫毒理学评价极为重要。另外，当受试物是已知的免疫调节剂的情况，或在安全性评价过程中初步发现对免疫系统有明显影响的药物也应进行免疫毒性的评价。在何种试验中进行免疫毒性的观察：建议在现有的长期毒性试验中，增加免疫系统损伤的评价指标。现长毒试验中对免疫器官变化关注的较少，进行病理组织学检查的主要是脾脏和胸腺。对脾、胸腺、淋巴结的详细检查，包括重量及病理组织学检查及骨髓的病理组织学检查更能反应出对免疫系统的损伤作用。即应将临床前安全性试验与确定药物对免疫系统功能影响的特殊评价结合起来，应合理选择综合性评价指标。进行免疫毒性评价时，通常需对免疫器官、免疫细胞、免疫分子（包括细胞因子）等进行分析。一种化合物或其代谢产物对淋巴细胞存活的直接效应，可通过受试物与特定的淋巴细胞体外共培养确定，并在不同时间里监测细胞活力。如果某些受试物体内给药能减少一种或多种细胞类型，而在体外培养时无此作用，则可能间接的作用于淋巴细胞。有些化合物可能抑制免疫功能8而不显著影响细胞数目，因此有必要对免疫功能进行分析。如用吞噬细胞摄取颗粒的能力和肿瘤活性的能力来评价某些受试物对其的影响。NK细胞抗肿瘤活性的测量，通常用标记YAC-1的肿瘤细胞作为靶细胞分析51Cr-的释放量来评价。淋巴细胞的信号传递途径和增殖能力，可通过有丝分裂原或者生理活性因子激活细胞来评价等。即应结合具体情况，选择合适的评价指标。（二）、试验中应考虑的问题1、动物选择用于检测潜在免疫毒性的临床前试验的受试动物应为健康动物，通常用啮齿类动物。受试动物在试验前应在试验场所进行适应性饲养。免疫毒性试验设计中要充分考虑到动物免疫系统的成熟程度等。2、给药途径应与拟用临床途径一致（如有特殊情况，需说明）。3、给药剂量建议设置三个剂量，低剂量应不低于药效试验有效剂量。应考虑出现免疫毒性的剂量和引起其他毒性的剂量的关系；注意观察出现免疫毒性的可逆性。4、给药时间每日给药，连续1个月或与长毒试验周期一致。5、检测指标用于检测受试物引起动物免疫毒性的指标应包括以下两级：（1）第一级：血液学（如白细胞计数等）、重量（如体重、脾重、胸腺重、肾脏重和肝重等）、脾细胞数和骨髓细胞数、淋巴器官组织学观察、IgM抗体形成空斑细胞（PFCS）、T淋巴细胞转化、混合淋巴细胞反应、B淋巴细胞转化和NK细胞活性；（2）第二级：B淋巴细胞、T淋巴细胞表面标志、IgG抗体形成空斑细胞计数、T淋巴细胞的细胞毒效应、ADCC作用、I型超敏反应（全身或局部）、迟发性超敏反9应及宿主对实验性感染或肿瘤移植的抵抗作用等。6、环境因素特定环境的环境，如群养、单养、温度、禁食、禁水、光照、固定、手术、给药方法和应激都会对实验动物的免疫系统产生影响。应尽量注意避免。在任何免疫毒性研究中，受试物的剂量、给药时间、给药方式应与发现不良反应的实验相一致。7、免疫功能的检测方法7.1体液免疫功能（见后）包括皮肤被动过敏试验、皮肤主动过敏试验、全身主动过敏试验及抗体滴度测定等。7.2细胞免疫功能包括淋巴细胞增殖反应，K细胞、NK细胞、巨噬细胞、抗原递呈细胞功能，以及宿主抵抗力试验（对抗原的抵抗试验及肿瘤细胞攻击试验）等。三、超敏反应试验（一）、试验中应考虑的问题中药、天然药物应进行何种变态反应研究，可根据药物自身特点、临床适应症和给药方式确定。通常局部给药发挥全身作用的药物（如注射剂和透皮吸收剂等）需考察Ⅰ型变态反应，如注射剂需进行全身主动过敏试验和皮肤被动过敏试验，透皮吸收剂需进行皮肤主动过敏试验等。Ⅱ和Ⅲ型变态反应可在进行长期毒性试验中选择相关指标进行观察，如观察动物的体征、