产甲烷菌菌落特性及分子生物学研究

METHANOGENEuryarchaeota产甲烷菌菌落特性及分子生物学研究METHANOGENEuryarchaeota厌氧发酵微生物概述1产甲烷菌分类及代谢途径2产甲烷菌富集与纯化3微生物群落研究方法4分子多样性研究5内容METHANOGENEuryarchaeota†厌氧发酵微生物概述不产甲烷菌产甲烷菌纤维素降解细菌半纤维素降解细菌淀粉降解细菌脂肪降解细菌产琥珀酸丝状菌溶纤维丁酸弧菌白色瘤胃球菌牛链球菌溶脂厌氧弧菌产氢产乙酸菌同型产乙酸菌挥发酸生成菌群基质分解菌群沃尔夫互营单细胞菌中温丙酸氧化菌伍德乙酸杆菌乙酸梭菌嗜热自养梭菌嗜甲基丁酸杆菌提供生长和产甲烷所需要的基质创造适宜的氧化还原电位条件为产甲烷菌清除有害物质METHANOGENEuryarchaeota†厌氧发酵微生物的发展史1901-1903年巴斯德研究所的Maze马氏甲烷球菌.1936HABarker发现沼气发酵分为产酸和分解酸形成甲烷两个阶段1950美国R.E.Hungate发明厌氧培养技术1868Bechamp甲烷形成是微生物学过程1899俄国奥姆良将厌氧分解纤维的微生物分为两类1916奥氏甲烷杆菌1901荷兰Sohngen氢和二氧化碳的混合气能发酵成甲烷1967Bryant采用改进Hungate技术纯化产甲烷菌1972三阶段理论1974Bryant首次提出了产甲烷菌(Methanogen)一词更先进的技术更完善的体系……METHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌的生物学特性专性厌氧1生长繁殖困难2•-320mV下正常生长•-160mV下生长缓慢•遇氧停止生长甚至死亡•十几天~几十天才出现菌落•菌落一般圆形、透明、边缘整齐•菌落特别小，很容易遗漏。可利用的底物很少：CO2、H2、乙酸、甲醇、甲基胺等METHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌的生物学特性特殊的细胞壁结构独特的产甲烷菌辅酶•甲烷吠喃(MFR)•甲烷喋呤•辅酶M(CoM)•辅酶F430•辅酶F420•HS-HTP•无肽聚糖骨架•蛋白质亚基和大量杂多糖组成•不受青霉素抑制•细胞内无细胞色素C34脂蛋白肽聚糖脂多糖孔道蛋白METHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌的分类根据可利用底物根据生长温度氢营养型：利用氢气和二氧化碳乙酸盐营养型：乙酸甲基营养型：甲醇、三甲基胺、二甲肽硫化合物以及其他的一些醇如异丙醇、异丁醇、乙醇、环戊醇嗜冷产甲烷菌：Topt25℃了苔原湿地、湖底沉积物嗜温产甲烷菌：Topt≈35℃厌氧消化器、淡水沉积物嗜热产甲烷菌：Topt≈55℃海底沉积物、热泉等极端嗜热产甲烷菌：Topt80℃METHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌甲烷生产途径H2/CO2途径乙酸途径甲基途径CO2+H2→CH4+2H2OΔG′0=-131kJ4CH3OH→3CH4+CO2+2H2OΔG′0=-319kJCH3COO-+H2O→CH4+HCO3-ΔG′0=-31kJCO2+H2→CH4+2H2OΔG′0=-131kJ4CH3OH→3CH4+CO2+2H2OΔG′0=-319kJCH3COO-+H2O→CH4+HCO3-ΔG′0=-31kJMETHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌的分类颗粒污泥外观特征颗粒污泥表面的菌群马氏甲烷球菌巴氏甲烷八叠球菌甲酸甲烷杆菌METHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌的分类METHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌显著影响因子第一PPT模板网，PPT素材下载微量元素缺乏会导致VFA高，气体产率下降。对毒性物质具有拮抗作用使反应器内优势菌种发生变化使乙酸利用率提高数倍。微量元素硫酸盐还原细菌和产甲烷细菌存在竞争关系，二者都以氢、乙酸、乳酸等为电子供体。硫化氢致害浓度为50mg·L-1，驯化后的500mg·L-1。硫酸盐最适pH值6.8~7.4pH值的变化可引起微生物体表面的电荷变化，影响培养基中有机化合物的离子化作用酶只有在最适宜的pH值时才能发挥最大活性。产甲烷菌最适宜的Eh为-350mV或更低，过高则停止生长甚至死亡。中温Eh应低于-300~-380mV高温厌氧消化系统-500~-600mVpH值氧化还原电位(Eh)METHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌富集与纯化方法样品采集繁殖培养纯化分离纯度检验水沉积物、沼泽、苔原、稻田、瘤胃、盲肠、地热温泉等碳源、氮源、维生素、微量元素、还原剂、指示剂培养基配好后先煮沸数分钟厌氧操作箱中进行接种操作，充入体积比4:1的H2/CO2培养10天后，重复上述过程四次。滚管分离涂片染色检验滚管观察在荧光显微镜下观察看其是否有蓝绿色荧光在荧光显微镜下标记产甲烷菌菌落，在厌氧操作箱中挑取菌落。菌种保存进行沼气发酵试验看其是否产生沼气4:1的H2/CO2，放置在4℃保存用悬浮液冷冻保存法保藏产甲烷菌METHANOGENEuryarchaeota†微生物群落研究方法进展•原位杂交•菌落杂交•Southern印迹杂交•斑点印迹杂交•狭线印迹杂交•荧光原位杂交核酸探针杂交技术复性RNADNA利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针；探针可以是长探针(100~1000bp)，也可以是短的寡核苷酸(10~50bp)。根据所用的探针和靶核酸的不同，杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA(核糖核酸)杂交，RNA–RNA杂交3类METHANOGENEuryarchaeota†微生物群落研究方法进展核酸探针杂交技术荧光原位杂交能快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列定性、定量分析微生物的存在、分布、丰度和适应性等荧光原位杂交((FluorescenceInSituHybridization，FISH)是目前单个细胞水平上分析微生物群落结构的常用分子生态学方法。用荧光标记探针，原位鉴定单个细胞,可原位分析它们的空间及数量分布。METHANOGENEuryarchaeota†微生物群落研究方法进展PCR-DEEG变性梯度凝胶(DGGE)和温度梯度凝胶(TGGE)：在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺(DGGE)，从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度(TGGE)。电泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。而且染色后的凝胶用成像系统分析。PCR-DEEG可以半定量地测定样品DNA浓度的大小，反映微生物群落组成的变化。METHANOGENEuryarchaeota†微生物群落研究方法进展PCR-DEEG16SrRNA的基因是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大(约占细菌RNA含量的80％)，分子大小适中，存在于所有的生物中，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故而被普遍用来菌种分析与鉴定过程中。METHANOGENEuryarchaeota†微生物群落研究方法进展RFLP分析7.6kb13kb物种II物种IHapⅠ7.6kb13kbSouthern印迹杂交I杂合子II分子探针DNA剪辑序列基因点突变、易位、倒位、缺失和转座等产生的改变会导致限制性内切酶(RE)的识别位点发生变化，进而使得部分具有同源序列的限制性片段大小发生变化，并在凝胶电泳中表现为不同的电泳迁移率。对每个DNA、RE组合来说，所产生的片段是特异的。METHANOGENEuryarchaeota†微生物群落研究方法进展RFLP分析设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物；应用特定的核酸内切限制酶切割有关的DNA分子，经过电泳，原位转膜印迹，探针杂交，放射性自显影后，分析与探针互补的DNA片段在长度上的简单变化。它可以在群落水平上提供几乎无穷尽的、反映基因型多样性的可靠证据，可作为一种能高度灵敏检测污染环境下微生物种群变化的方法。由于16SrDNA的限制性片段长度多态性(RFLP)分析(ARDRA)所产生的片段多，分析起来工作量大。人们又在此基础上发展了一种高效、灵敏的方法末端标记限制性片段长度多态性分析(T-RFLPs)。该方法在用通用引物PCR扩增16SrDNA时，在其中一条引物的5’末端用荧光素进行标记，对标记了的末端片段进行多态性分析。这种方法有效而快速。METHANOGENEuryarchaeotaRAPD分析QR3'3'5'5'上游引物下游引物荧光标记引物PCR-SSCP实时荧光定量PCR利用随机引物对目的基因组DNA进行PCR扩增，产物经电泳分离后显色，分析扩增产物DNA片段的多态性，此即反应了基因组相应片段由于碱基发生缺失、插入、突变、重排等所引发的DNA多态性。DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。†微生物群落研究方法进展METHANOGENEuryarchaeota†菌株的系统分类学分析方法产甲烷菌16SrDNA序列分析：由于16SrDNA序列的保守性及物种之间的差别性，产甲烷菌目前系统分类的主要依据为16SrDNA序列的分析。16SrDNA序列的分析分为以下几个过程：DNA的制备16SrDNA序列的扩增扩增片段的纯化制备感受态大肠杆菌扩增片段的转化质粒DNA的提取测序及结果分析METHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌的基因组特征产甲烷菌基因组大小一般介于1.6×106~5.7×106bp之间甲烷杆菌目、甲烷球菌目和甲烷火菌目的基因组均为1.7×106bp左右。甲烷八叠球菌目的基因组大小有较大差异，长度在3.4×106bp、5.7×106bp，也有的基因组大小仅为2.2×106bp。甲烷微菌目和甲烷胞菌目的基因组大小在2.8×106~3.5×106bp之间。产甲烷菌的基因组一般由一条环状染色体组成,也有一些产甲烷菌除了含一条染色体之外，还存在环状染色体外元件ECE，而且染色体和ECE的GC含量有较大差别产甲烷菌基因组的GC含量在30%~65%之间，这与产甲烷菌所生存的环境有密切的关系，产甲烷菌生长所处的环境温度越高，一般GC含量也越高。值得注意的是，甲烷球菌目的菌株GC含量均较低，基本介于30%~35%METHANOGENEuryarchaeota†产甲烷菌的基因组特征目Order科Family种Genus基因组(bp)Genome(bp)G+C(%)基因Gene阅读框ORF登录号Number甲烷杆菌目Methanobacteriales甲烷杆菌科Methanobacteriaceae热自养甲烷热杆菌Methanothermobacterthermautotrophicusstr.DeltaH175137749.519211873NC_000916马堡甲烷热杆菌Methanothermobactermarburgensisstr.Marburg163913548.618061757NC_014408甲烷球菌目Methanococcales甲烷球菌科Methanococcaceae詹氏甲烷球菌MethanococcusjannaschiiDSM2661173993331.318231771NC_000909海沼甲烷球菌MethanococcusmaripaludisC517807613318891822NC_009135海沼甲烷球菌MethanococcusmaripaludisC6174419333.418881826NC_009975海沼甲烷球菌MethanococcusmaripaludisC7177269433.318551788NC_009637海沼甲烷球菌MethanococcusmaripaludisS2166113733.117721722NC_005791海沼甲烷球菌MethanococcusmaripaludisX1174669732.918901848NC_0158