中药成分提取、分离纯化

第二章中药化学成分的一般研究方法（总论）中药化学成分类型及生物合成简介第一节中草药中各类化学成分简介一、有效成分1.碱性化合物：生物碱NOCH3OCH3OOOH+-小檗碱2.酸性化合物：结构中含有酚羟基的化合物——黄酮、醌类、苯丙素（香豆素、木脂素）及其苷类结构中含有羧基的化合物——有机酸、葡萄糖醛酸OOHOOOOHOHOHOOOHHOOHOHOH黄酮蒽醌香豆素木脂素3.两性化合物：结构中既有碱性基团也有酸性基团氨基酸、蛋白质4.中性化合物：分子结构中既无碱性基团也无酸性基团的化合物，如萜类和挥发油、甾体等。中药化学成分大多属于天然有机化合物，类型众多，结构复杂，数目庞大。然而其结构间却存在着一定的联系，许多化合物在分子结构中都包含着某些基本组成单位。植物在体内物质代谢过程中由不同的生物合成途径产生出结构千差万别的代谢产物。苯丙素类具有C6-C3单位萜类具有重复的C5单位具有C6-C3-C6单位黄酮类具有C2单位。脂肪酸、酚类、醌及聚酮类生物碱类具有氨基酸单位按成分的生物合成途径可分为一次代谢产物和二次代谢产物一次代谢产物是每种植物中普遍存在的维持有机体正常生存的必需物质，如叶绿素、糖类、蛋白质、脂类和核酸等。中药化学的主要研究对象。二次代谢产物是在特定的条件下，以一些重要的一次代谢产物（如乙酰辅酶A等）作为前体或原料，经历不同的代谢过程生成的物质（如生物碱、黄酮等）。中药二次代谢产物的主要生物合成途径一、乙酸-丙二酸（AA-MA）途径二、甲戊二羟酸（MVA）途径三、莽草酸途径四、氨基酸途径五、复合途径六、中药中其他成分类型一、乙酸-丙二酸（AA-MA）途径以乙酰辅酶A为起始物质，丙二酸单酰辅酶A起延伸碳链的作用。通过这一途径能生成脂肪酸类、酚类、醌类等化合物。乙酰辅酶A直线聚合后再进行环合生成各种酚类化合物。CH3-CO-S-CoA+3乙酰辅酶A丙二酸单酰辅酶ACH3-CO-CH2-CO-CH2-CO-CH2-CO-----Enz上述多酮环合则生成各种醌类化合物或聚酮类化合物。COOHCH2-CO-S-CoA起始物质为MVA，萜类、甾类化合物均由这一途径生成。由乙酰辅酶A歧式聚合生成的甲戊二羟酸单酰辅酶A是中药体内生物合成各种萜类、甾类化合物的基本单位。二、甲戊二羟酸（MVA）途径MVA具有C6-C3及C6-C1基本结构的化合物由这一途径衍化生成，如苯丙素类、木脂素类、香豆素类等。此途径由莽草酸通过苯丙氨酸，生成桂皮酸，再由桂皮酸生成各种苯丙素类化合物。现也被称为桂皮酸途径。三、莽草酸途径大多数生物碱类成分由此途径生成。有些氨基酸，如鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等，经脱羧成为胺类,再经过一系列化学反应(甲基化、氧化、还原、重排等)生成各种生物碱。四、氨基酸途径许多二级代谢产物由上述生物合成的复合途径生成，即分子中各个部分由不同的生物合成途径产生。如：查耳酮类、二氢黄酮类化合物的A环和B环分别由乙酸-丙二酸途径和莽草酸途径生成，再在各种酶作用下生成黄酮。一些萜类生物碱分别来自甲戊二羟酸途径及莽草酸途径或乙酸-丙二酸途径。五、复合途径中药化学成分预实验第二节是初步检识某中药中含有哪些化学成分的方法，根据预实验结果，在按照所含化学成分的性质，设计有效成分提取、分离的具体方法。水浸液乙醇提取液石油醚提取液预实验提取、分离中药有效成分常用的方法第三节提取：指用选择的溶剂或适当的方法，将所要的成分溶解出来并同中药组织脱离的过程。溶剂提取法水蒸气蒸馏法升华法一、溶剂提取法是根据天然药物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对有效成分溶解度大，而对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，将有效成分从药材组织中溶解出来的办法。（一）原理：根据中药化学成分与溶剂间“极性相似相溶”的原理，依据各类成分溶解度的差异，选择对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂，依据“浓度差”原理，将所提成分从药材中溶解出来的方法。溶剂提取法相似相溶定律有机化合物分为三类水溶性亲脂性亲水性苷类（黄酮、三萜、甾体等与糖的结合物）糖类、氨基酸蛋白质、盐类未成盐的生物碱，未成苷的黄酮、蒽醌、萜类、甾体。化合物的极性及其强弱判断官能团的种类、数目、排列方式官能团的极性强弱（二）化学成分的极性：被提取成分的极性是选择提取溶剂最重要的依据。1、影响化合物极性的因素：(1)、化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。(2)、取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。常见基团极性大小顺序如下；酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞酮＞酯＞醚＞烯＞烷。OHOCOCH3OABC(三)提取溶剂及溶剂的选择：1.常用提取溶剂的分类与极性：有机溶剂分为三类水亲水性有机溶剂亲脂性有机溶剂与溶剂的结构有关，常见溶剂极性强弱顺序:石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水极性大小：水(H2O)＞甲醇(MeOH)＞乙醇(EtOH)＞丙酮（Me2CO）＞正丁醇(n-BuOH)＞乙酸乙酯(EtOAc)＞乙醚(Et2O)＞氯仿(CHCl3)＞苯（C6H6)＞四氯化碳(CCl4)＞正己烷≈石油醚(Pet.et)。溶剂的选择：溶解度化学性质稳定安全、价廉（1）要对所提取成分溶解度大；对杂质溶解度小。（2）要与所提取成分不起意外的化学变化。（3）要廉价、易得、安全。其中（1）是最主要的。提取溶剂的选择（1）水：为极性最大的溶剂，也最常用。可溶解苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、有机酸盐、亲水性色素、无机盐。其中蛋白质不溶于热水。缺点：用水提取易酶解苷类成分，且易霉坏变质。（2）亲水性的有机溶剂：以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。优点：应用范围广，易过滤，不霉变，易浓缩回收。缺点：价高、不安全，需回流设备。（3）亲脂性的有机溶剂：这些溶剂的选择性能强，用于亲脂性成分的提取，如游离生物碱、苷元、挥发油等。优点：提取专属性强，易回收浓缩。缺点：价高、易燃、有毒，穿透性差；对设备要求高。浸渍法（冷浸）煎煮法（热提）回流法（有机溶剂）连续提取法渗漉法（连续冷浸）提取方法水蒸气蒸馏法冷提法1.浸渍法：是用水或醇浸渍药材一定时间，然后合并提取液，并将其减压浓缩的方法。该法因为一般都是在低温下进行的，不用加热，所以适合于挥发性成分及受热易分解成分的提取。但提取的时间较长，效率低。用水浸提时还要注意提取液的防腐问题。2.渗漉法：是将药材装入渗漉筒中，先用水或醇浸渍数小时，然后从渗漉筒的下口使提取液流出，上口不断地加入新的溶剂，此方法因为药材与溶剂之间能够始终保持较大的浓度差，因此提取效率较高。该法同样适用于挥发性及受热易破坏分解的成分的提取。但是有溶剂耗费量较大的缺点。热提法1.煎煮法：该方法是我国中医中药最早使用的传统的提取方法。是将药材用水加热煮沸提取，在提取过程当中大部分成分可被不同程度的提取出来，但是对于挥发性成分及加热易被破坏的成分不宜使用。2.回流提取法：是用有机溶剂作为提取溶剂，在回流装置中对药材进行加热回流提取，该方法提取效率较高，但因为长时间加热，所以不适合受热易破坏分解的成分。3.连续回流提取法：是回流提取法的发展，具有消耗溶剂量更小，提取效率更高的优点。常用索氏提取器或连续回流装置。二、水蒸气蒸馏法三、升华法四、超零界提取法超临界提取法（SFE）1特点：与经典溶剂提取法比较，不用有机溶剂，而是选用一种称为超临界流体（SF）的物质替代有机溶剂提取。2优点：1）可在低温下提取，“热敏性”成分尤其适用。2）无溶剂残留，对作为制剂的中药提取物的提取是一大优势。3）提取与蒸馏合为一体，无需回收溶剂。4）具选择性分离。3超临界流体（SF）：指处于临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上，介于气体和液体之间的、以流动形式存在的物质。二、各种分离纯化方法系统溶剂分离法两项溶剂萃取法沉淀法盐析法分馏法结晶法色谱法中草药有效成分的分离与精制根据物质的溶解度差别进行分离根据物质在两相溶剂中的配比不同进行分离根据物质的吸附性能差别进行分离根据物质分子大小差别进行分离根据物质离解程度不同进行分离一、根据物质的溶解度差别进行分离1.结晶及重结晶法：利用温度变化引起溶解度的改变使物质得以分离。结晶溶剂的选择：①对要结晶的成分，热的时候溶解度大，冷时溶解度小②沸点小，易挥发，利于溶解回收③无毒或低毒结晶纯度的判断：①形态，颜色②熔点和熔距③色谱法2.溶剂分离法：a.通过加入另一种溶剂以改变溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。如：水提醇沉法b.酸性、碱性或两性化合物，通过加入酸或碱来调节溶剂的PH值，改变分子的存在状态（游离型或离解型），从而改变溶解度而实现分离。3.沉淀法：酸性或碱性化合物通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类等沉淀析出而实现分离。如生物碱加入有机酸可生成不溶于水的有机酸盐沉淀，酸性化合物可加入钙盐、铅盐、钡盐等生成不溶性的沉淀。1水醇沉淀法：1）水提取醇沉淀法，于水提浓缩液中加入乙醇使含醇量达60%以上，可使多糖、蛋白质沉淀。2）醇提取水沉淀法，于醇提取浓缩液中加入10倍量以上水，可沉淀亲脂性成分。2铅盐沉淀法：利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐沉淀而分离的方法。3酸碱沉淀法：1）酸提取碱沉淀：用于生物碱的提取分离。2）碱提取酸沉淀：用于酚、酸类成分和内酯类成分的提取、分离。4专属试剂沉淀法某些试剂能选择性地沉淀某类成分，称为专属试剂沉淀法。二、根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离液-液分配的基本原理1.分配系数K值:一种溶质在两相溶剂中的分配比。K值在一定的温度和压力下为一常数。K=CU/CL2.分离因子β：两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。β=KA/KB(KAKB)β≥100，一次萃取就可实现基本分离100≥β≥10，需萃取10~12次β≤2，需萃取100次以上β≌1，无法实现分离3.分配比与PH：溶剂系统PH的变化影响酸性、碱性、及两性有机化合物的存在状态（游离型或离解型），从而影响在溶剂系统中的分配比。游离型——极性小的溶剂离解型——极性大的溶剂一般PH3，酸性物质多呈非离解状态（HA）、碱性物质则呈离解状态（BH+）；PH12，则酸性物质呈离解状态（A－）、碱性物质以非离解状态（B）存在。纸色谱法支持剂：纤维素固定相：纤维素上吸附的水展开剂：与水不相混溶的有机溶剂或水饱和的有机溶剂Rf值：极性大，Rf值小；极性小，Rf值大。应用：适合于亲水性较强的物质。OHOCOCH3OABCOHOHOHHOAB三、根据物质的吸附性差别进行分离固-液吸附应用的最多吸附类型：1.物理吸附（溶液分子与吸附剂表面分子的分子间作用力）：硅胶、氧化铝及活性炭为吸附剂的吸附色谱。2.化学吸附：如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝吸附，生物碱被酸性硅胶吸附等。3.半化学吸附：如聚酰胺与黄酮类、蒽醌类等化合物之间的氢键吸附。介于物理吸附与化学吸附之间。物理吸附基本规律→相似者易吸附固液吸附三要素：吸附剂、溶质、溶剂1.极性吸附剂（氧化铝、硅胶）特点：a.对极性强的物质吸附能力强b.溶剂极性减弱，则吸附剂对溶质的吸附能力增强；反之，则减弱。c.溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，一旦加入极性较强的溶剂时，又可被置换洗脱下来。2.非极性吸附剂（活性炭）：对非极性物质亲和能力强，溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低；反之，则提高。1.凝胶滤过法分离原理：反分子筛凝胶为在水中可膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。大分子在颗粒间隙移动，较早流出；小分子则自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，通过色谱柱时阻力增大，较晚流出。因而，化合物按分子量由大到小顺序得到分离。两相溶剂萃取法1原理：利用混合物中各单体组分在两相溶剂中的分配系数（K）不同而达到分离的方法。溶剂分配法的两相往往是互相饱和的水相与有机相。混合物