脂肪氧合酶

脂肪氧合酶（EC1.13.1.13)是种氧化还原酶，其结构中含有非血红素铁，能催化含顺，顺-1,4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸，通过分子加氧，生成具有共轭双键不饱和脂肪酸的氢过氧化物。脂肪氧合酶分类结构与催化机制脂肪氧合酶酶学特性脂肪氧合酶抑制机制脂肪氧合酶应用细菌植物动物真菌5-LOX8-LOX12-LOX13-LOX9-LOX13-LOXMn-LOX15-LOX10-LOX9-LOX13-LOXMini-LOX15-LOX大豆植物体中的LOX-B是只有一条链的单聚体蛋白，分子量大约为95kDa，约有853个氨基酸残基，并含2个结构域：N端具有160个氨基酸残基，由2个4股反平行板的β桶结构形成。C端具有693个氨基酸残基，由23个α螺旋，2个反平行β板与活性位点铁离子（Fe2+）组成。目前普遍认为脂肪氧合酶的催化中心与铁离子有关，其活化态为高自旋的氧化型Fe3+，非活化态为高自旋的还原型Fe2+。在大豆LOX-1中，铁离子中心含有5个内源配体和1个外源配体，内源配体包括三组组氨酸残基（His499，His504，His690）一个Ile839残基及一个Asn694,外源配体为水分子。在大豆LOX-B中，铁离子中心仅含有5个内源性配体即His513,His518，His704，Asn708和Ile853。哺乳动物中的铁离子中心含有四个组氨酸残基配体（His361，His366，His541，His545）和一个C-末端异亮氨酸残基配体（Ile593)。VLX-B的底物结合部位大约由三个分支部分组成，其中有两个分支在催化点附近急剧弯曲，使其能容纳亚油酸底物。这两个弯曲内腔是由Q509和I552残基的侧链组成的。这两个保守性氨基酸残基分别与亚油酸底物的C-14和C-8相毗邻。Fig.5.(A)ResiduesconstitutingsubcavityIIathatareconservedamongthefoursoybeanlipoxygenases.TheshapeofsubcavityIIaofVLX-B,linoleicacid(violetstickmodel),andiron(pinkball)aredepicted.Fig.4.TheshapeofsubcavityIlaofVLX-B、LOX-1.TheO2cavity(redarrow)，extendedcavity(bluearrow),andentrancesite(greenarrow)areindicated.Theironisdepictedthebyredball(B).Theviewin(B)is~45°rotatedfromtheviewin(A),alongthehorizontalaxis.InLOX-1，themodeledlinoleicacidisdepictedinvioletcolor.自由基理论••LOXs的区域专一性和立体专一性取决于反应pH、底物结合口袋的深度和宽度、进入的多不饱和脂肪酸底物头到尾的方向（即羧基端或甲基端先）、特定脱氢（L型或D型）、氧进攻方向（-2或+2方向）和氧与底物结合的方位（相同或相反）。其中，多不饱和脂肪酸中顺，顺-1,4-戊二烯C-3亚甲基基团的结构与催化铁部位的接近程度是关于位置控制的一个决定因素。区域专一性主要体现在①立体选择性地去除氢②通过中间环节脂肪酸自由基重新选择异侧氧插入位点。可采用酶与底物相互作用的结构数据和模型来解释酶的区域专一性，首先先介绍两种模型：①底物脂肪酸可能以甲基端头穿过活性位点，使亚油酸13-脂氧合作用发生——空间相关模型；②底物以反向的“头到尾”方向进入活性位点，使亚油酸9-脂氧合作用发生——定向依赖模型。如：在黄瓜脂肪体13-LOXs中，底物结合口袋的底部存在一个组氨酸或苯丙氨酸残基的空间，而在9-LOXs中存在一个缬氨酸残基空间。该位点是位置专一性的基本决定因素。若它被较小的空间取代，充满缬氨酸和蛋氨酸残基，则亚油酸13-LOX的位置专一性会变为9-LOX。有文献指出当亚油酸作为底物时，酶作用后存在4种潜在的异构体和对映体。迄今为止，在所有已分析的LOXs中，在酶活性位点（即“Coffa位点”）只有一种氨基酸参与了这部分反应。底物特异性大豆中LOX-1、LOX-3、VLX-B、VLX-D天然底物主要是亚油酸和亚麻酸，其中VLX-D还可催化甘油三酯。大部分哺乳动物最适底物是花生四烯酸，但鱼类的LOX的最适底物变化较大，如鲑鱼的LOX的最适底物是DHA，白鲢鱼和沙丁鱼的LOX的最适底物是亚麻酸。最适温度大豆中LOXs在低温下（40℃）具有较高的活性；南美白对虾血淋巴中LOX最适温度为25℃；罗非鱼鳃组织中LOX最适温度为30℃；小球藻中LOX最适温度为35℃。最适pH大豆中LOXs最适pH为9.0；南美白对虾血淋巴中LOX最适pH为9.6；罗非鱼鳃组织中LOX最适pH为10.0和4.0；小球藻中LOX最适pH为7.4和9.6。动力学性质大豆中LOXsKm=80.6μmol/L，Vmax=54.2μmol/(L•min)；南美白对虾血淋巴中LOXKm=0.5mmol/L，Vmax=1670U/mg•min；罗非鱼鳃组织中LOXKm=0.073mmol/L，Vmax=30800U/mg•min；小球藻中LOXKm=104.18mmol/L，Vmax=4.12μmol/mg•min。脂肪氧合酶在植物的生长、发育、成熟衰老以及抵御机械损伤和病虫侵染等逆境过程中起着重要的调节作用。对于脂肪氧合酶活性抑制的研究，是研究果实的成熟衰老的关键。脂肪氧合酶对食品风味和色泽也有一定的影响。因此研究脂肪氧合酶活性的抑制特别是大豆及其制品的豆腥味、油脂的劣变等是研究食品风味和香味的关键。半胱氨酸、VC、BHT和TBHQ等抗氧化剂对脂氧合酶活性有抑制作用；有研究表明，厚朴和白芍这两种中草药的95%乙醇提取液对其活性有较好的抑制作用。与底物竞争酶的活性部位抑制剂可以作为底物参与反应，从而抑制LOX活性。例如：VC对LOX活性的抑制作用。螯合作用抑制剂与Fe2+发生螯合作用后，使LOX保持非活化状态。例如，罗勒和山奈提取物，儿茶素与酶的活性中心Fe2+相互作用，从而导致酶的失活。还原作用当Fe3+被还原成Fe2+时，LOX活性会受到抑制。例如，硒化物和去甲二氢愈创木酸可以抑制LOX，抑制机理即是将Fe3+转变成Fe2+。竞争脂质自由基有一些抑制剂可能是和催化过程中的自由基发生反应，从而使链式反应终止。有研究表明在β-胡萝卜素抑制LOX的过程中，β-胡萝卜素的添加可以减小LOX催化反应过程中共轭二烯基的生成速率。β-胡萝卜素是在链反应开始时和亚油酸自由基(L·)反应，转变成它的初始状态(LH)，因此酶就不能完成链反应。与β-胡萝卜素抑制机理相似的还有栎精，它在40μmol/L时具有最大的抑制作用，此时可以抑制LOX活性30%。制备香精香料脂肪酸在脂肪氧合酶作用下氧化产生氢过氧化合物，氢过氧化合物通过均裂或β-裂变分解，形成了小分子的醇、醛、酮、酯等多种风味物质和热反应风味前体物质。将其作为天然肉味香精的基料，可用于制备各种类型的肉味香精。钟秋等人利用脂肪氧合酶催化氧化鸡脂，采用“脂肪氧化—热反应”方法制备出肉香味浓郁、和谐且特征为突出的鸡肉香味。孙佳等人采用脂肪酶和脂肪氧合酶双酶法作用于猪肉，制备出香精香味饱满，猪肉特征突出且脂香浓郁的猪肉香味。焙烤工业在面粉中加入1%含脂肪氧合酶活力的大豆粉，能改进面粉的颜色和焙烤质量。其原理：脂肪氧合酶可通过偶合反应导致胡萝卜色素被漂白，面粉颜色可有所改善；脂肪氧合酶生成的氢过氧化物起着氧化剂作用，面筋蛋白质的巯基被氧化形成二硫键，形成稳定的三维网状结构；脂肪氧合酶的加入可防止结合态脂肪的产生，增加游离脂肪的数量，改进面包的体积和松软度。医药行业脂肪氧合酶(LOX)能催化底物生成各种类花生酸物质，在癌症预防和治疗中发挥重要作用，有望成为新的抗癌药物作用靶点。5-LOX可催化花生四烯酸代谢形成不稳定的环氧化物白三烯（LTA4），进而有可能水解成LTB4等。LTB4是一种很强的致炎物质，可导致急性肺损伤，哮喘病等。15-LOX基因产物可能作为一种抗炎因子和细胞膜重塑的调节因子，也可能是一种潜在的肿瘤抑制因子。有研究报道，15-LOX对乳腺癌、胰腺癌和结肠癌都具有抑癌活性。对脂肪氧合酶的研究大约已有70多年的历史，越来越多的研究者开始利用基因沉默、基因删除等手段对转基因植物中LOX进行研究，同时不断改进LOX产物分析方法，从而推动LOX途径及代谢产物生理作用的研究。LOX的动力学以及抑制机理的研究是今后重点研究的方向。同时可利用分子生物学手段从分子水平深入揭示LOX的代谢途径、LOX通路在癌症治疗方面的调节作用、对植物体衰老的作用机制等。