中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞ATP生成的影响

[e-mail]20071028;15(30):3159-3162ISSN1009-3079CN14-1260/RBASICRESEARCH中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞ATP生成的影响EffectoftraditionalChinesemedicineWeichangshuonATPingastrointestinalsmoothmusclecellsXiao-DongSong,Meng-AnLiu,Feng-RunSun,YingLiu,Li-XiaZhang,Xin-HuaNiu,Miao-MiaoYan,Xiao-JiangWangXiao-DongSong,Li-XiaZhang,Xin-HuaNiu,Miao-MiaoYan,Xiao-JiangWang,theBasicSchoolofBinzhouMed-icalCollege,Binzhou256603,ShandongProvince,ChinaMeng-AnLiu,Feng-RunSun,YingLiu,ClinicalSchoolofBinzhouMedicalCollege,Binzhou256603,ShandongProvince,ChinaSupportedby:NationalNaturalScienceFoundationofChina,No.30672680Correspondenceto:Xiao-DongSong,DepartmentofBiology,BinzhouMedicalCollege,Binzhou256603,Shan-dongProvince,[e-mail]:2007-05-29Revised:2007-09-29AbstractAIM:TostudytheeffectofWeichangshuonthekineticenergyofgastrointestinalsmoothmusclecells.METHODS:Gastrointestinalsmoothmusclecellsweredividedintofivegroups:control,culturedinnormalmedium;cisapride,culturedinnormalmediumwith0.51g/Lcisapride;Weichangshu,culturedinnormalmediumwith25g/LWeichangshu;Weichangshu,culturedinnormalmediumwith50g/LWeichangshu;andWeichangshu,culturedinnormalmediumwith75g/LWeichangshu.Celltiter-GlowasusedtodetectATP.Therela-tivechangesinmitochondrialpotentialweretestedwiththerhodaminefluorescence(R-123)technique.RESULTS:AfterexposuretoWeichangshufor24hours,thechangeinATPcontentwasmoresignificant(P0.05)andtheintensityofR-123fluorescenceingastrointestinalsmoothmusclecellswassignificantlyincreasedcomparedwiththoseinthecontrolandcisapridegroups.AstheWeichangshuconcentrationincreased,sodidthecontentofATPandmitochondrialpotential.CONCLUSION:Weichangshumaychangethekineticenergyofgastrointestinalsmoothmusclecells,leadingtoanimprovementingastrointes-tinalmotility.KeyWords:TraditionalChinesemedicine;Weichangshu;ATP;Mitochondrialpotential;Celltiter-GloTMmethod;RhodaminefluorescencetechniqueSongXD,LiuMA,SunFR,LiuY,ZhangLX,NiuXH,YanMM,WangXJ.EffectoftraditionalChinesemedicineWeichangshuonATPingastrointestinalsmoothmusclecells.ShijieHuarenXiaohuaZazhi2007;15(30):3159-3162目的:.方法:,5:、(0.51g/L)、(25g/L)、(50g/L)、(75g/L),Celltiter-GloTMRhodaminefluorescenceATP.结果:24hATP.ATP(P0.05).,,,.结论:.®,,,、、、、、、.,,,.关键词引言胃肠运动障碍型疾病是临床常见病,据国内统计约占胃肠专科门诊患者1/3以上,西方国家患病率高达20%-40%.现临床最常用的促胃肠动力药有胃复安、吗丁啉、西沙必利等化学药.化学药促进胃肠蠕动虽然有较好疗效,但其副作用如药理作用受限、催乳素增加、焦虑、激动、运动性不安、共济失调、腹泻、腹痛等不可忽视[1-2],且易于复发.而中药制剂具有治疗与调理双层作用,受到广大胃病患者的欢迎.但目前国内外有关中药胃肠动力药的研究少见报道,因此开发中药治疗该类疾病具有重要意义[3].纯中药制剂胃肠舒是根据《伤寒论》大承气汤、小承气汤、调胃承气汤三方化裁,取大黄、枳壳、甘草组方,经临床反复药物筛选研制而成,具有完全知识产权.预实验[4-7]显示,胃肠舒对胃轻瘫综合征的疗效优于吗丁啉,对小鼠子宫切除术后肠道推进作用优于西沙必利,能显著加快小鼠胃肠推进运动,兴奋兔离体肠平滑肌,并且无明显副作用,比单味中药更切合临床实际,比汤剂更方便.因此我们在离体胃肠平滑肌细胞模型上进一步探讨胃肠舒的促胃肠动力的作用及其机制.1材料和方法1.1胃肠舒由滨州医学院附属医院制剂室提供,西沙必利浙江京新药业股份有限公司生产,标准SD大白鼠由烟台绿叶实验动物中心提供,DMEM培养基购自GiBco公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司,Rhodamine123购自Sigma公司,CellTiter-GloTM试剂盒购自Promega公司,LabsystemsMultiskanMS酶标仪和HERACO2培养箱及CK×41倒置显微镜购自Olympus,EPICSXL流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司,IX71荧光倒置显微镜购自日本奥雷帕斯公司.选择标准SD大白鼠,体质量为180-200g,雌雄各半,乙醚麻醉,剖腹后迅速剪取胃体、空肠组织,PBS清洗后剪碎,去除上清液,重复清洗3160ISSN1009-3079CN14-1260/R2-3次.将盛有组织碎片的容器置于冰上,去除残留的上清液,加入2.5g/L胰蛋白酶,在4℃孵育6-18h.移弃组织碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20-30min.待小块组织完全消化溶解后,过200目网,1000r/min离心7min.弃上清液,向细胞沉淀中加入新鲜配制的200mL/L胎牛血清DMEM培养液,轻轻吹打,后按每瓶(25mL)3×104活细胞接种在培养瓶里,放入37℃孵箱里静置培养待测,CK×41倒置相差显微镜观察.将处理好的盖玻片,放入6孔板使之与孔底贴和紧密,进行细胞培养.细胞生长5d后吸去培养液,先用PBS洗涤已贴壁盖玻片2-3次.950mL/L乙醇室温固定20min,PBS洗2-3次.1mL/LTritonX-100室温孵育20-30min增强细胞通透性.正常羊血清于37℃封闭20min.滴加一抗兔抗鼠α-actinmAb(1∶200,购自Sigma公司)室温过夜,滴加二抗羊抗兔FITC-IgG(1∶100),37℃孵育2h,倒置荧光显微镜(波长500nm)观察.1.2实验分为5组,分别为空白对照组、胃肠舒小剂量组Ⅰ组(25g/L)、胃肠舒中剂量组Ⅱ组(50g/L)、胃肠舒大剂量组Ⅲ组(75g/L)、西沙必利组(0.51g/L).每组6个复孔,各组药物作用24h,Celltiter-GloTM试剂盒A液和B液混合,室温下静置1h.向96孔板的各孔细胞中每孔加入100μLCelltiter-GloTM混合液,5min后酶标仪波长562nm检测胃肠平滑肌细胞ATP含量.另将待测胃肠平滑肌细胞离心1000r/min收集,PBS清洗2次,加入1mL的终浓度为1mg/L的Rhodamine123,放入37℃孵箱里静置培养45min.PBS清洗2次,倾去原有液体,250μLPBS重悬,缓慢加入-20℃乙醇750μL,流式细胞仪激发波长488nm、发射波长525nm检测胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位.组间比较用方差检验,P0.05为差异有统计学意义.2结果倒置显微镜下观察可见细胞形状椭圆形,束状排列,密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状.峰处为多层细胞,谷处为单层或双层细胞,培养4d后细胞铺满培养瓶瓶底.为确定胃肠平滑肌细胞离体分离培养成功,用兔抗鼠α-actinmAb进行鉴定,细胞经漂洗后置于荧光显微镜下观察.负载了FITC的细胞经500nm的波长激发下产生荧光,可见95%以上的细胞显示阳性荧光标记,说明离体培养的平滑肌细胞成功.2.1ATP胃肠舒片作用24h后能显著增高平滑肌细胞ATP的含量.随着胃肠舒用药浓度的增加改变ATP的含量也加大,ATP的改变量与正常对照组和西沙比利组进行t检验(P0.05)(图1).2.2胃肠舒组细胞荧光分析图与对照组相比右移,表示线粒体跨膜电位上升.胃肠舒实验组明显比空白对照组增大线粒体的跨膜电位,比西沙必利组改变线粒体跨膜电位的幅度也大,并且随着胃肠舒用药浓度的增加,胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位随之增加(图2).3讨论从中医学观点看,胃肠运动障碍型疾病多由于脾胃功能失调,升降失司,气机不畅所致.治疗重在调理脾胃功能,协调升降,舒畅气机.本研Gm:1.52CV:144.99[0-1023]202947(100.0%)10240Counts100101102103104Gm:1.90CV:133.33[0-1023]190278(100.0%)10240Counts100101102103104Gm:2.08CV:125.67[0-1023]158906(100.0%)10240Counts100101102103104Gm:1.76CV:131.94[0-1023]197015(100.0%)10240Counts100101102103104RH123RH123RH123RH123AA'BB'Gm:2.48CV:120.71[0-1023]179366(100.0%)10240Counts100101102103104Gm:2.71CV:124.94[0-1023]211420(100.0%)10240Counts100101102103104Gm:3.14CV:117.41[0-1023]190278(100.0%)10240Counts100101102103104Gm:2.26CV:129.46[0-1023]152768(100.0%)10240Counts100101102103104RH123RH123RH123RH123CC'DD