临检4―细胞计数技术

检验医学教研室1第一章血液学一般检验六、血细胞显微镜计数法Xingyue检验医学教研室检验医学教研室2细胞计数是检验工作者最基本、也是最常用的技术之一，直接计数法显微镜计数法间接计数法计数方法半自动血细胞分析仪法多参数分析全自动Xingyue检验医学教研室3血细胞计数人工显微镜计数法自动血细胞计数仪法Xingyue直接计数法间接计数法半自动（二、三分群）全自动（五分群）检验医学教研室4显微镜细胞计数法【测定方法及评价】将样本做适当稀释（或浓缩），有时还需特殊染色，充入细胞计数池，在显微镜下计数计数板中一定体积内细胞数，经换算得每升标本的细胞数。如：血液RBC、WBC、PLT、嗜酸细胞、嗜碱细胞、淋巴细胞和单核细胞直接计数，体液细胞计数（尿中细胞管型、精液中精子计数、脑脊液及浆膜腔积液细胞计数）等。该法计数误差较大，费时、费力，已不能适应大批量标本的测定，将逐渐被血细胞分析仪所取代。Xingyue检验医学教研室5【试剂】各种不同的专用稀释液或染色稀释液。【器材】（1）显微镜（2）微量吸管：Hb吸管：10、20μl两刻度★毛细玻璃吸管：10、20μl两刻度一人一管，定期用水银称重法进行校正误差应±1%（3）计数板：血细胞计数板，常用改良Neubauer计数板计数板的构造：（4）血盖片规格24mm×20mm×0.6mm，要求：表面平整（不平整性＜0.002mm），高倍镜检查无裂痕，且本身有一定的重量。Xingyue血细胞计数板的构造24×20×0.6mm计数池划线1mm1mm计数池划线美国国家标准局（NBS）1941年规定：计数池大方格每边长度的误差应在±1%内（1±0.01mm）;血盖片与计数池间缝隙深度应在±2%以内(0.1±0.002mm)。检验医学教研室9计数池的参数区域边长（mm）面积（mm2）深度（mm）体积（mm3）计数池390.10.9大方格110.10.1计WBC中方格0.250.06250.10.00625计RBC中方格0.20.040.10.004计RBC小方格0.050.00250.10.00025检验医学教研室10【操作】（以血WBC计数为例）WBC稀释液0.38ml+血20μl混匀后30s后灌板,静置2～3min后以低倍镜计数四角4个大方格内WBC数（计数原则）计算WBC数/L=四个大方格细胞数/4×10×20×106/L=四个大方格细胞数×0.05×109/LXingyue检验医学教研室11【注意事项】(1)计数的标本必须新鲜,及时计数。(2)稀释液要过滤,试管、吸管、计数板要清洁，避免杂质等污染。(3)采血量要准确，避免凝血，要擦去吸管外的血液，放血时用上清液冲洗管壁2～3次。(4)灌板前要充分混匀，适当用力快速震荡30s，但要避免产生过多的气泡，要一次充满。(5)加盖片方式：WHO推荐采用“推式”，较“盖式”更准确。(6)注意区别灰尘、杂质。Xingyue检验医学教研室12【质量控制】显微镜技术的误差可分为技术误差和固有误差两种1.技术误差：由于操作不正规或使用器材不精确造成的误差。这类误差通过主观努力可以避免或显著减小，属系统误差。常见技术误差：①使用器材不符合要求：②采血部位不当，③稀释倍数不准；④充液不当；如未混匀、冲液过多、产生气泡、盖片移动、操作台不平等。⑤血液凝固。⑥误认Xingyue检验医学教研室132.固有误差：显微镜计数法中包括计数域误差、吸管误差、计数室误差三种。（1）计数域误差：即使一个技术熟练的人，使用同一器材，同一份稀释细胞悬液，多次重复计数，结果仍有一定的误差。这是由于充池后细胞在计数室内分布不可能完全相同所造成的误差，叫固有误差或计数域误差，此属偶然误差。这种误差可因计数更多的细胞而减少，但不能完全消除。如：在同一计数池中，计数100个细胞将可能出现4%的误差，若计数1000个细胞时，误差将减少至2.9%。根据统计学原理，血细胞在计数室内分布的不均一性符合Poisson分布，s=√m,CV(%)=s/m×100=1/√m×100说明在计数室内计数面积越大，计数的细胞越多，计数域误差越小。Xingyue检验医学教研室142.固有误差：（2）吸管误差和计数室误差是由吸管和计数室不精密引起。Bekson（1940）固有误差公式：CV=√(0.92☓100)2/ηb+(4.6)2/ηc+(4.7)2/ηpηb:实际计的细胞数ηc：计数室使用次数ηp：吸管使用次数认为，当使用一支吸管和计数板的一边计数室，计数0.2mm2面积的细胞数,CV值可望达到能接受的7%以内。检验医学教研室15思考题1.血细胞计数板的构造、划线及细胞计数的计算方法。2.计数池、血盖片、微量吸管有何技术要求？3.血细胞显微镜计数的误差有哪些？白细胞计数区域及计数原则