SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质解析

实验八SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质一、目的要求1.学习电泳原理和技术2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术二、原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-105×1052-5核酸(RNA)10415–20104–1055-10105-2×1062-2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3图2夹心垂直板电泳槽示意图图3凝胶模示意图1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统返回不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。（1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应(3)电荷效应图4电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。图5不连续系统浓缩效应示意图SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。三、试剂与器材试剂：10%SDS、凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0mol/LpH8.9Tris－HCl缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5mol/LpH6.7Tris－HCl缓冲液）、10%过硫酸铵、10%TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、1%琼脂糖溶液、0.05％考马斯亮兰R250、7%醋酸器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床五、操作方法1.安装夹心式垂直板电泳槽(1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。(2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。•2配胶表SDS–不连续体系凝胶的制备配制20mL不同浓度的分离胶配制10mL浓缩试剂名称所需试剂用量/mL所需试剂用量/mL7.5%10%15%3%凝胶贮液5.006.6610.01.00分离胶缓冲液(pH8.9Tris-HCl)2.502.502.50—浓缩胶缓冲液(pH6.7Tris-HCl)———1.2510%TEMED0.100.100.100.0510％SDS0.200.200.200.10重蒸水12.1010.447.107.55混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%过硫酸铵0.100.053.制备凝胶板将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将上、下贮槽的蒸馏水倒去，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10min左右，上胶即可聚合，再放置10-20min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。4.样品的处理及加样将样品按0.5–1mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。用微量进样器取25l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。5.电泳将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。6.染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色1-2h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。7.结果处理量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR:相对迁移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)六、注意事项（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。（2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。（3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。（4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。七、思考题(1)为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的蔗糖溶液？蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么？