微透析-液相色谱-化学发光联用微透析技术应用于中药药动学的研究(张群林)

微透析-液相色谱-化学发光联用技术应用于中药药动学的研究安徽医科大学药学院张群林副教授[e-mail]13053068912汇报内容一个人简历二化学发光技术三液相色谱—化学发光联用技术四微透析在体采样技术五丹参药动学研究3ANHUIMEDICALUNIVERSITYANHUIMEDICALUNIVERSITY个人简历1992.9-1996.6沈阳药科大学中药系1996.7-2000.8安徽省药物研究所中药新药研发2000.9-2005.6中国科学技术大学获分析化学博士学位（导师：崔华教授）2005.7“安徽医科大学引进人才”2005.7－现在药学院药物分析教研室2006.8任副教授、硕士生导师、中青年学术带头人2009.7任教研室主任•化学发光[1]作为一种自然现象很早就为人类所注意•1877年，Radziszewski[2]证实在乙醇－KOH溶液中洛粉碱(Lophine,2,4,5-三苯基咪唑)被H2O2等氧化发出绿光•十九世纪末期，德国科学家Wiedemann[3]首次解释了化学发光的机制[1]B.T.P.Whitehead,L.J.Kricka,et.al.Clin.Chem.25(1979)1531.[2]B.Radziszewski,Chem.Ber.10(1877)70.[3]E.Wiedemann,Ann.Phys.Chem.34(1888)446.化学发光现象是一种相对简单的有机反应过程化学发光(Chemiluminescence,CL)[4]R.Dubois,Acad.Sci.132(1901)431.[5]K.vanDyke,F.McCapra,I.Behesti,BioluminescneceandChemiluminescence,InstrumentsandApplications.Vol1.FL:CRCPress,1985.[6]K.Gleu,Z.Petsch.Angew.Chem.48(1935)57.•1901年，法国生物学家Dubois[4]引入了荧光素(Luciferin)和荧光素酶(Luciferase)的概念•1902年，Schmitz合成发光试剂鲁米诺(Luminol),它曾被广泛用于血迹鉴定；1928年,Albrecht观察到鲁米诺在碱性介质中的化学发光行为[5]•1935年,Gleu和Petsch[6]报道了光泽精(Lucigenin)与H2O2反应产生化学发光这些发光试剂的合成，对于化学发光发展为分析化学的一种重要手段起到了非常重要的作用化学发光(CL)的发展历史•由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，早期的化学发光研究主要集中在对化学发光反应现象的观察和反应机理的探讨上，其发展一直比较缓慢。•1945年出现了光电倍增管，1950年出现了商品化的化学发光检测装置•到了八十年代，随着生命科学、环境科学和材料科学的兴起，化学发光才被真正应用于分析化学并迅速得到了发展目前，化学发光分析的研究和应用已成为当前微量和痕量分析领域一个十分重要的研究方法化学发光(CL)的发展历史化学发光(CL)的优点1.灵敏度极高荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2.线性范围宽至少二个数量级以上3.仪器设备简单不需要光源、单色器和背景校正4.分析速度快多数化学发光反应是快速反应，在瞬间或几秒即可完成,100samplesh-15.易于自动化适合与HPLC和HPCE等其它的分离技术联用，作为其高灵敏度的检测器化学发光(CL)的基本原理化学反应释放出的化学能激发产物分子或体系共存的其它分子，这些分子由激发态回到基态时产生光辐射的现象。一.化学反应必须释放出足够的能量可以使某种反应产物或中间体到达激发态；二.反应历程必须有利于形成激发态产物；三.这种激发态物质必须具有一定的发光量子效率，或者能够将其能量转移给共存的某种荧光物质，产生光辐射。化学发光(CL)的必须条件化学发光(CL)的基本类型直接化学发光A+B→C*+DC*→C+hυ间接化学发光A+B→C*+DC*+F→C+F*F*→F+hυ化学发光(CL)的定量原理定量原理：在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：dc/dt=Kc定量依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性cttcttIAttcl0cl0cldddd化学发光(CL)的常见反应体系鲁米诺及其衍生物发光体系吖啶类发光体系四价铈发光体系其它发光体系复杂体系中低含量物质的检测——分析化学挑战之一高选择性和高灵敏度的分析技术化学发光是高灵敏分析技术，灵敏度可与质谱媲美分布广泛、疗效确切的黄酮，易于发生氧化还原反应前期工作基础液相色谱—化学发光（HPLC-CL）联用技术分析中药黄酮成分ChemiluminescenceProducinglightwithchemicals化学发光(Chemiluminescence)技术液相色谱-化学发光联用技术发光新体系规律和机理指纹图谱（复方）制剂葛根素注射液中葛根素含量的测定OOOHHOOOHHOHOHOPuerarin线性范围:1.3×10-9-8.0×10-7g/mL检测限:8.4×10-10g/mLR.S.D.:1.86%(n=11)at5.0×10-8g/mL首次报道化学发光法测定葛根素JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2004,36(3):587–592草豆蔻中豆蔻明含量的测定OHOHOOCH3Cardarmonin线性范围:1.0×10-8-8.0×10-6g/mL检测限:1.2×10-9g/mLR.S.D.:1.15%(n=11)at8.0×10-7g/mL首次报道化学发光法测定豆蔻明PhytochemicalAnalysis,2005,16(1-2):440-445.中药沙棘制剂中的三种黄酮含量的测定沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡颓子科沙棘属的植物，主要种植于中国的北方和西南地区。它是一种传统的中草药，很早以前就被人们用于止咳、助消化、促进血液循环和止痛。沙棘油还可以治疗皮肤病和血栓。300510152025300.00.20.40.60.81.0QUKAISTime(min)Absorbance(a.u.)a05101520253050010001500200025003000ISKAQUTime(min)RelativeCLIntensity(a.u.)b图2槲皮素、山萘酚和异鼠李素标准化合物的DAD(a)和CL(b)检测色谱图QU,IS:4.5×10-7gmL-1KA:2.0×10-7gmL-1051015202530400800120016002000ISKAQUTime(min)RelativeCLIntensity(a.u.)a0510152025304008001200160020002400ISKAQUTime(min)RelativeCLIntensity(a.u.)b图3心达康胶囊(a)和沙棘颗粒(b)样品中三种黄酮醇的CL检测色谱图JournalofSeparationScience,2005,28(11):1117-1256.图4二十种黄酮和酚类化合物的化学发光检测色谱图首次报道能同时响应化合物种类最多的CL检测器JournalofChromatographyA2005,1095,94-101.黄酮具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等显著药理作用，受到国内外医药界的广泛重视，但其药动学研究资料的缺乏，制约了黄酮类新药的研发与体内作用机制研究生物样品中痕量黄酮的高通量、高灵敏分析技术是研究药动学的基本前提中药药动学研究所面临的生物样本具有药物含量低（样品中的中药成分浓度常在ng/mL水平或以下）、药物浓度变化范围大（需要测定的血药浓度范围为峰浓度Cmax―1/20Cmax）、干扰组分多且不确定、样品不易重复获得等特点HPLC-CL联用技术应用于黄酮药动学研究24ANHUIMEDICALUNIVERSITYANHUIMEDICALUNIVERSITY液相色谱–化学发光法测定大鼠血浆中山奈酚浓度及其药动学研究25ANHUIMEDICALUNIVERSITYANHUIMEDICALUNIVERSITY研究背景山奈酚的性质药理作用广泛，药动资料缺乏仅有两篇报道：家兔灌胃，HPLC-DAD，前处理复杂大鼠静注，HPLC-UV，未报道药动学参数OHOOOHOHHO123456781'2'3'4'5'6'26ANHUIMEDICALUNIVERSITYANHUIMEDICALUNIVERSITY实验方法HPLC-CL条件的优化1.色谱分离条件HPLC-CL条件的优化流动相不增加背景、不熄灭发光信号；不生成沉淀发光试剂混合次序发光反应试剂的浓度、试剂流速等2.发光反应兼容性3.流路的优化4.发光反应条件分离度、峰形、保留时间02468107007508008509009501000105011000.00.10.20.30.40.50.60.70.80.97008009001000110012001300140015000.30.40.50.60.71440146014801500152015400.51.01.52.02.53.03.52004006008001000120014001600RelativeCLIntensity(a.u.)ConcentrationofRhodamine6G(mol/l)abRelativeCLIntensity(a.u.)ConcentrationofCerium(IV)(mmol/l)cRelativeCLIntensity(a.u.)ConcentrationofSulfuricAcid(mol/l)dFlowRate(ml/min)RelativeCLIntensity(a.u.)27ANHUIMEDICALUNIVERSITYANHUIMEDICALUNIVERSITYHPLC-CL实验装置示意图DADComputerInterfacePMTCellHPLCPumpInjectionValveHPLCColumnPeristalticPump1.5mL·min-1Rho6G0.4%aqueousphosphoricacidMethanolWaste1.5mL·min-1Cerium(IV)MixingTee28ANHUIMEDICALUNIVERSITYANHUIMEDICALUNIVERSITY血浆样品的预处理方法取血浆样品100μL，精密加入内标溶液（0.2mg·mL-1异鼠李素）5.0μL，20%的磷酸溶液10μL酸化，加甲醇200μL，涡旋混合1.0min，离心（10000r·min-1）10min后，取上清液10μL进样。29ANHUIMEDICALUNIVERSITYANHUIMEDICALUNIVERSITY方法学考察专属性1线性关系和检测限2精密度、准确度与提取回收率3稳定性430ANHUIMEDICALUNIVERSITYANHUIMEDICALUNIVERSITY结果专属性0510152025050100150200250300350400450500KAISRelativeCLIntensity(a.u.)RetentionTime(min)abc123SampleBlankBlank+KA+IS31ANHUIMEDICALUNIVERSITYANHUIMEDICALUNIVERSITY结果线性关系和检测限线性范围：2.0×10-9－2.0×10-6g·ml-1线性方程：y=0.8626x+5.553(r=0.9991,n=7)检测限：1.0×10-9g·mL-1。32ANHUIME