基因工程的操作程序1概要

复习旧知：限制酶DNA连接酶分布：特点：作用：作用的部位：结果：主要是原核生物只能识别特定的核苷酸序列并在特定位点上切割DNA分子切割DNA分子磷酸二酯键黏性末端或平末端种类：作用：连接部位：连接类型：E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶连接DNA片段磷酸二酯键E.coliDNA连接酶：T4DNA连接酶：黏性平或黏性3.基因的载体——“分子运输车”⑵载体必须具备的条件：①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；②具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接；③具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）④对受体细胞无害⑴作用：①将外源基因转移到受体细胞中去。②利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。⑶常用的载体有：质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等质粒质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中,酵母菌中也有分布，是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的小型环状DNA分子。要对天然质粒进行人工改造能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。质粒种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用的底物作用部位作用结果DNA分子磷酸二酯键形成黏性末端或平末端DNA分子片段磷酸二酯键磷酸二酯键形成重组DNA分子脱氧核苷酸形成子代DNA分子DNA分子氢键形成单链DNA分子§与DNA有关酶的比较图示1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子终止子:DNA分子中终止转录的核苷酸序列。启动子：是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质，且能聚合转录所形成的mRNA。RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列.包括启动子和终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子2、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列非编码序列：包括非编码区和内含子上游：下游：启动子终止子原核细胞不具有剪切、拼接mRNA的能力，所以真核细胞的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码注意：终止子与终止密码的区别1、终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位是脱氧核苷酸2、终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基，其组成单位是核糖核苷酸如何让大肠杆菌生产胰岛素？1.2基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取(一)、目的基因是指______________________编码蛋白质的结构基因和一些具有调控作用的因子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成1、从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库（2）基因文库的种类基因组文库：含有一种生物的所有基因部分基因文库：如：cDNA文库）：含有一种生物的部分基因（1）.基因文库①基因组文库的构建（3）.基因文库的构建方法通过对受体菌的培养而储存基因②cDNA文库的构建-----反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)cDNA文库的构建mRNA反转录cDNA(互补DNA）DNA聚合酶双链DNA②反转录法：基因重组反转录酶mRNAcDNA③基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性④从基因文库中得到目的基因的方法2、利用PCR技术扩增目的基因…DNA变性（90℃-95℃）退火（复性55℃-60℃）延伸（70℃-75℃）①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物耐热的DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d、多次重复3、人工合成适用于基因比较小，核苷酸序列已知的基因注意：该过程不需要复制的模板注意：1、PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较（名师7页）2、特别提醒7页3、规律方法：7页二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?目的基因：外源DNA分子的有效片段启动子位置：功能：基因的首端是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA终止子位置：功能：基因的尾端终止转录标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因（1）.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）.用_____________切断目的基因，使其产生_____（3）.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶切口DNA连接酶相同的黏性末端3.构建过程:取质粒取DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种？？……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来质粒片段目的基因片段……GAATTC…………CTTAAG……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……同一种重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因自连质粒自连GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG如何防止自身环化呢GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGA2）双酶切割GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGCTTAAATCTAGAATTCGGATCTA重组体GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGAATTCGGATCTA优势：防止目的基因、质粒的自身环化使目的基因和质粒定向连接结论：不同的限制酶也可产生相同的黏性末端。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTAGGATCTCCTAGA不同的酶能切出相同的黏性末端吗？酶1：BamHⅠ识别—GGATCC—,切点在G与G之间；酶2：BglⅡ识别—AGATCT—，切点在A与G之间；粘性末端均为——CTAG和GATC——。构建基因表达载体需要考虑的因素7页特别提醒7页练习7页例2①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意三、将目的基因导入受体细胞1、转化：2、方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达（1）将目的基因导入植物细胞的方法：①农杆菌转化法农杆菌介绍：原核生物，自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力，对植物分泌的酚类物质有“趋化性”。利用农杆菌Ti—质粒上的T-DNA（可转移的DNA），构建基因表达载体，然后导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞a原理：b优点：遗传性状稳定，成功率高。（目的基因直接插入植物染色体的DNA上）②基因枪法：③花粉管通道法将基因表达载体包裹于金属颗粒表面，利用压缩气体产生的动力将其送入受体细胞，（单子叶植物常用该法，成本高。）在花粉管没愈合之间，减去柱头，滴加含目的基因的DNA，使目的基因进入受体细胞，简单经济。（2）将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：（3）、将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射移植进子宫新性状动物用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功1、检测(1)检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因A.首先取出转基因生物的基因组DNAB.将目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中①方法:DNA分子杂交②过程:分子水平的归纳步骤(2)检测目的基因是否转录出了mRNA(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质①方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA.目的基因蛋白质小鼠体内抗体目的基因受体细胞蛋白质抗原抗原杂交分子检测目的基因是否翻译成蛋白质----抗原抗体杂交2、鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定用转基因抗虫作物饲喂相应害虫用相应致病菌（或病毒）剂喷洒转基因抗病作物检测相应物质是否有天然物质的作用个体水平归纳步骤归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基