抗核抗体检测及临床应用

抗核抗体（ANA）检测与临床应用传统定义：针对细胞核成分的自身抗体的总称。广义定义：针对细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解不再局限于核成分，而是指核酸和核蛋白抗体的总称ANA的靶抗原分布：细胞核整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。ENA：抗可提取核抗原，包括RNP/Sm,Sm,SSA,SSB,Scl-70和Jo-1等六种靶抗原抗核抗体的定义现阶段检测方法•抗核抗体定量检测间接免疫荧光法，每个样本按1:100和1:1000两个浓度制片•抗核抗体谱检测免疫印迹法•抗中性粒抗体定量检测（MPO和PR3）酶联免疫法•抗线粒体抗体定量检测酶联免疫法•IFT（间接免疫荧光法）BLOT（免疫印迹法）ELISA（酶免法）EUROLINEANA谱最多18种抗原，增加了RNP亚单位自动化操作全自动化结果判读实验结果的解释（ANA谱）：抗nRNP/Sm和Sm抗体抗nRNP/Sm抗体抗Sm抗体结果解释--nRNP:-Sm:-阴性++nRNP:？Sm:+SLE+-nRNP:+Sm:-SLE或MCTD-+结果不可靠无抗核抗体（ANA）荧光片判读与讲解ANA筛查:间接免疫荧光法(IFT)抗原谱完整(细胞核、细胞浆)检测ANA的金标准，具有很高的敏感性和特异性基质组合:HEp-2细胞+灵长类肝读片要点HEp-2细胞:选取多个视野判断HEp-2细胞:分裂间期与分裂期细胞综合看HEp-2与肝片综合看根据产生的荧光模型、靶抗原的分布部位分类如下：ANA细胞核细胞浆抗核抗体荧光模型分类核均质型：dsDNA、组蛋白和核小体等核膜型：板层素、gp210等核糖核蛋白：Sm、nRNP、SS-A、SS-B核颗粒型细胞周期蛋白：I型（PCNA）和II型Ku核仁型：Scl-70、RNA多聚酶、PM-Scl和原纤维蛋白等核浆点型：着丝点、核点等胞浆颗粒型：线粒体、Jo-1、核糖体等胞浆纤维型：波形蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白等分裂期细胞：纺垂体、中间体、中心粒等核均质型肝片HEP-2•HEp-2：间期细胞核呈均匀荧光，分裂期细胞浓缩染色体荧光增强•肝片：肝细胞核阳性，呈均匀荧光。荧光强度与HEp-2基本一致•靶抗原：dsDNA、核小体、组蛋白核粗颗粒型肝片HEP-2•肝片：肝细胞核呈颗粒样荧光。核仁阴性；荧光强度与HEp-2基本一致•HEp-2：间期细胞核呈颗粒样荧光，核仁阴性；分裂期细胞浓缩染色体阴性，染色体周围呈颗粒样荧光•靶抗原：nRNP、Sm核细颗粒型肝片HEP-2•肝片：肝细胞核呈颗粒样荧光。部分核仁阴性；荧光强度明显弱于HEp-2•HEp-2：间期细胞核呈细颗粒样荧光，部分核仁阴性；分裂期细胞浓缩染色体阴性，染色体周围呈颗粒样荧光•靶抗原：SS-A、SS-B着丝点型肝片HEP-2•肝片：肝细胞核内可观察到10-20个荧光点；荧光强度明显弱于与HEp-2细胞•HEp-2：间期细胞核内出现大小数目相同、均匀分布的点状荧光；分裂期细胞浓缩染色体处出现浓缩点状荧光•靶抗原：着丝点蛋白核点型肝片HEP-2•肝片：肝细胞核内出现大小、数目不均一的点状荧光；荧光强度与HEp-2基本一致•HEp-2：间期细胞核内出现大小、数目、强度不均的点状荧光；分裂期细胞浓缩染色体阴性。周围可见点状荧光•靶抗原：Sp100核膜型肝片HEP-2•肝片：肝细胞核呈现特征性环状荧光•HEp-2：间期细胞核呈现均匀荧光，核周增强；分裂期细胞浓缩染色体阴性•靶抗原：板层素、gp210核仁型肝片HEP-2•肝片：肝细胞核仁阳性；荧光强度与HEp-2基本一致•HEp-2：间期细胞核仁阳性；分裂期细胞浓缩染色体阴性。•靶抗原：Scl-70、PM-Scl、RNA多聚酶、原纤维蛋白核仁型的多种模型原纤维蛋白PM-SclRNA多聚酶Scl-70胞浆颗粒型：抗核糖体P蛋白抗体肝片HEP-2•肝片：灵长类肝组织中可呈现特异的由几个肝细胞浆融合形成的岛状荧光•HEp-2：间期细胞浆中出现致密的细颗粒样荧光，并有空泡现象，部分核仁阳性；分裂期细胞浓缩染色体阴性•靶抗原：核糖体P蛋白胞浆颗粒型：抗线粒体抗体肝片HEP-2•肝片：肝细胞呈颗粒样荧光，整个视野呈细沙状荧光•HEp-2：细胞浆内粗颗粒样荧光•靶抗原：线粒体胞浆颗粒型：抗Jo-1抗体肝片HEP-2•肝片：荧光模式不典型•HEp-2：间期细胞浆中出现颗粒到细块状荧光，细胞核有时也出现细颗粒荧光；分裂期细胞浓缩染色体阴性，染色体周围区域呈致密的细颗粒荧光•靶抗原：Jo-1胞浆颗粒型：抗溶酶体抗体肝片HEP-2•肝片：荧光模式不典型•HEp-2：细胞浆中出现细小的、中等大小的、以及粗的滴状荧光颗粒•靶抗原：溶酶体胞浆颗粒型：抗高尔基体抗体肝片HEP-2•肝片：荧光模式不典型•HEp-2：间期细胞核一侧的高尔基体所在部位呈现网状的颗粒样荧光；分裂期细胞无荧光。•靶抗原：高尔基体抗中心粒抗体肝片HEP-2•肝片：荧光模式不典型•HEp-2：在细胞核内可见一或两个荧光点，分裂期细胞中荧光点位于细胞纵向对称的两极抗纺锤体纤维抗体肝片HEP-2•肝片：荧光模式不典型•HEp-2：仅见于分裂期细胞，纺锤体部位出现特征性荧光。抗中间体抗体肝片HEP-2•肝片：荧光模式不典型•HEp-2：分裂中期细胞中间水平方向产生带状细颗粒荧光，半数间期细胞含有大量粗荧光点，其余细胞为阴性。常规片特点经常出现混合核型经常出现不典型核型中低滴度常见、经常出现临界滴度实验操作、实验体系等因素，会给荧光结果的判读带来不利影响。均质+核点核颗粒+核仁均质+核仁•ANA可见于多种疾病，特别是结缔组织疾病，常作为结缔组织病的诊断、病情判断和疗效观察的指标•在非结缔组织病中也可出现阳性。•正常人中（特别是老年人）也可出现阳性，但滴度低，并且常表现为IgM型•高滴度ANA则高度提示自身免疫性疾病目前，ANA检测已成为临床上的一个极重要的自身免疫病的筛查实验。ANA检测的临床意义美国风湿学会(ACR)立场声明•HEp-2HEp-2细胞包含大约100至150种自身抗原•其它初筛方法仅具有少量自身抗原(8-10))•细胞包含大约100至150种自身抗原•其它初筛方法仅具有少量自身抗原(8-10)…大约35%SLE患者和IFT-ANA阳性患者在其它初筛实验中为阴性结果…建议：•IFT-ANA仍然为ANA检测的金标准!•医院或商业诊断所应用其它ANA检测方法时，必须要求为临床大夫提供足够的数据证明其它ANA检测方法与IFT比较具有同样或更高的敏感度和特异性.•实验室在ANA报告当中必须注明ANA检测方法.EUROIMMUNHEp-2:筛查不同的自身抗体ANAhomogenNucleardotsCentromereANAnucleolarScl-70Sm/RNPSS-A/SS-BNuclearmemb.RibosomesMitochondriaGolgiapparat.LysosomesActinVimentin欧蒙推荐的ANA稀释方案欧蒙ANA—IIF稀释方案欧蒙ANA间接免疫荧光法检测系统的起始稀释度为1:100。即该检测系统的正常参考范围为1:100。梯度稀释时的稀释因子为1:3.2。推荐每个标本至少平行做两个稀释度：1:100和1:1000。由于不同厂家ANA检测系统的起始稀释度和稀释因子不同，因而不同厂家的ANA滴度结果不能直接进行比较。欧蒙研究：各风湿病ANA阳性率在不同滴度水平的分布欧蒙实验室推荐的ANA稀释方案起始稀释度：1:1001:1,000报告结果EUROIMMUN原因1:高滴度抗体在低稀释倍数时可能被非特异性反应遮盖抗Yo抗体(猴小脑)1:101:100抗表皮基底膜抗体(喉舌)1:101:100AMA(鼠肾)1:1001:1000pANCA(人中性粒细胞)1:11:10推荐一个标本平行作两个稀释度1:100和1:1000(1)原因2：在低稀释倍数时多种自身抗体可能相互掩盖1:10001:1000ANA核均质型和着丝点型1:1001:100ANA核均质型和核仁型推荐一个标本平行作两个稀释度1:100和1:1000(2)推荐一个标本平行作两个稀释度1:100和1:1000(3)两个滴度平行检测：1:100和1:1,000，通过一次实验，就可估计抗体的滴度1:1,000ANA均质型（滴度1:10,000）1:1001:1,000ANA均质型（滴度1:1,000）1:100ANA结果报告报告ANA结果时，应包括如下几个方面：-定性结果：阴性或阳性。-荧光模型：看到的所有模型均应报告。-每种荧光模型的滴度。-建议：如下一步的确认实验等。慢性炎症性结缔组织病(CICTD)慢性炎症性结缔组织病(CICTD)SystemischerLupusErythematodes(SLE)干燥综合征(SS)系统性硬化症(SSc)RheumatoideArthritis(RA)多肌炎/皮肌炎(PM/DM)夏普综合征(MCTD)系统性红斑狼疮(SLE)ANCA相关性血管炎dsDNAScl70andCenpBMyositisProfileSSAandSSBRNP系统性红斑狼疮(SLE)红斑狼疮的特点临床大夫:容易误诊的一类致死性疾病免疫学家:所有免疫系统的要件均参与致病机理产生过程临床发病特点发病率:40/100,000(北欧);200/100,000(黑人);250,000(美国)患者寿命:4年/50%(1950);15/80%(当前);20岁诊断/35岁死亡几率1:6系统性红斑狼疮(SLE)CharacteristicAntibodiesdsDNA30-90%Nucleosomes50-95%Sm5-10%RibosomalP-Proteins5-15%•高度特异性抗体;•70%患者阳性，0.5%正常人或RA患者阳性•滴度与疾病活动性相关，但不适用于所有患者•抗体滴度上升但临床症状不明显的患者，抗体检测后5年内80%患者进入活动期抗dsDNA抗体与SLE核均质:抗核小体抗体(ANuA)靶抗原:dsDNA-组蛋白-复合物的构象决定簇方法:IIFAELISA,Blot临床意义:SLE,阳性率50-95%(100%specific)抗核小体ELISA:敏感性、特异性、疾病活动度ANuA与疾病的活动性相关性强(SLEDAIscore)分组n抗核小体阳性SLE233144(61.8%)干燥综合症411(2.4%)皮肌炎/多肌炎401(2.5%)系统性硬化症331(3.0%)类风湿/骨关节炎601(1.7%)强直性脊柱炎200健康对照组310特异性22598.2%Suetal.,ClinImmunol122:115-120,2007ANuA与狼疮性肾炎LNTP(%)LN(%)CON(%)ANuA79189Anti-dsDNA434133LNTP=lupusnephritisrequiringrenaltransplantationLN=biopsyprovenlupusnephritisCON=SLEpatientswithoutnephritis•狼疮肾炎是SLE的一种潜在的严重并发症(高达50%)•大约1.2%需要进行肾移植的患者有狼疮肾炎伴有狼疮肾炎的严重SLE的生物标记物Stintonetal.,Lupus15:394-400,2007干燥综合征（Sjögren‘sSyndrome）外分泌腺受累的自身免疫疾病症状:-口腔干燥-唾液及眼泪减少-腮腺肿胀-胰腺外分泌腺分泌不足口腔干燥腮腺肿胀干燥综合征CharacteristicAntibodiesSS-A(60kDa)40-95%SS-B(47kDa)40-95%Anti-Ro52:风湿性疾病中的阳性率疾病nAnti-Ro-52positive干燥综合症8881%系统性硬化症8128%肌炎2631%SLE21038%MCTD2119%RA1655%Anti-Ro52在干燥综合症中阳性率较高，但没有疾病特异性Meyer,Schlumbergeretal.,4thAsianCongressonAutoimmunity