植物新基因克隆的策略与方法

植物新基因克隆的策略与方法生命科学学院杨清小麦水稻番茄马铃薯植物生长发育与基因马铃薯3GTcDNA的核苷酸序列与对应的氨基酸序列基因的概念基因mRNA结构为何进行基因克隆?-研究特定性状的遗传；-用于改良植物的遗传特性。如何从植物中获得（取出）新基因?有两个策略:基于基因组DNA的克隆；基于cDNA(基因差异表达)的克隆。基于基因组DNA的克隆即是以DNA为模板或对象的克隆。图位克隆T-DNA标签法转座子标签法图位克隆图位克隆(mapbasedcloning),是由英国剑桥大学Coulson等人于1986年首次提出。原理是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库（包括BAC、YAC、TAC、PAC等），构建目的基因区域的物理图谱，再利用此图谱通过染色体步移（chromosomewalking）逐步逼近目的基因，最终克隆目的基因，并通过遗传转化试验证实目的基因的功能。技术流程技术特点优点:-应用范围广，可以克隆所有类型的基因；-不受基因大小限制，可以克隆大片段基因；-克隆的基因是基因全长，包含编码序列和非编码序列。局限：-需要遗传群体；-工作量大，时间长。应用图位克隆法已经被广泛地应用在植物新基因的克隆中。已分别克隆到拟南芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因，如：-番茄pto基因(Martin等,1993)；-水稻Xa21基因(Wenyuan等,1995)。T-DNA标签法T-DNA(TransferDNA)是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti(tumorinducing)质粒上的一段DNA，它可以从农杆菌中被转移并稳定整合到植物核基因组中。原理T-DNA标签法以人工构建好的T-DNA作为标签，通过农杆菌转化植物，构建突变体库，在对突变体鉴定的基础上，根据插入片段设计引物扩增突变体中插入点侧翼的植物基因组序列，最终实现快速鉴定和基因克隆。技术流程1）遗传转化，获得T-DNA插入突变体；2）通过分子和遗传方法鉴定突变体；3）提取DNA,酶切,环化,反向PCR扩增突变基因；4）经序列分析后,从野生型对照中克隆突变基因。图1􀀁反向PCR示意图技术特点优点：-方法简单；-易获得大量突变体。不足：-由于T-DNA插入是随机事件，会出现多点插入或在一点多片段插入，导致后期筛选的复杂性。转座子标签法转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段;在转座过程中原来位置的DNA片段(转座子)并未消失,发生转移的只是转座子的拷贝;基因发生转座可引起插入突变使插入位置的基因失活并诱导产生突变型或在插入位置上出现新的编码基因。在植物上,目前使用的转座子有:玉米的Ac/Ds和En/Spm,金鱼草的Tam3;这些转座子不仅能够同源转座,而且还能异源转座;转座子可以转到DNA分子的任意位置,但不是随机的。原理转座子标记法是应用遗传转化方法将转座子转入受体植物中，利用转座子的特性，从分离后代中鉴定突变体，然后采用反向PCR技术克隆突变位点基因。技术流程(1)将已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体；(2)把转座子导入目标植物；(3)利用Southern杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中；(4)采用反向PCR技术克隆突变位点基因。技术特点转座子标签法具有与T-DNA标签法类似的优点。但该法的效果受到转座子自身的位置效应和计量效应的影响。应用目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物中克隆出抗性基因，如：-玉米的HMI特异真菌抗性基因。基于cDNA(基因差异表达)的克隆以cDNA(mRNA)为模板的基因克隆。功能克隆法DDRT-PCR技术cDNA-AFLP技术SSH技术RAP-PCR技术高通量测序技术电子克隆功能克隆法这是一个建立在差异蛋白组分析基础上的基因克隆方法。原理在对获得的克隆蛋白测序的基础上,据此合成寡核苷酸探针,从cDNA文库或基因组文库中筛选编码基因;或者,将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA文库中筛选相应克隆。再通过测序获得基因的全长序列。技术流程蛋白质双向电泳获得蛋白表达图谱；比较处理与对照蛋白图谱的差异，找出差异蛋白点；回收差异蛋白，纯化，测序；根据蛋白序列，预测其编码基因序列，通过点杂交，从cDNA文库中获得目标克隆；通过测序获得全长基因序列。应用功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。如：-从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2)；-从水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)；-从烟草中克隆了编码黄瓜花叶病毒病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等,1989)；-从感病的烟草叶片中克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因(王春香等,1991)。mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)DDRT-PCR(differentialdisplayreversetranscriptionPCR)。1992年美国哈佛医学院的两名科学家LiangP和PardeeAD根据高等生物成熟的mRNA都带有poly(A)的特性，用特定的锚定引物反转录后，进行PCR扩增，率先建立了mRNA差异显示技术。1994年EricHay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT-PCR）。原理真核生物基因的mRNA3′端多数都带有一段多聚腺苷酸结构，有12种组合：5′-NMAAA…AA-3′其中N代表A、G、C、T任意一种碱基，M代表G、C、T任意一种碱基。根据此种序列特征，按碱基配对的原则，人工合成Poly(dT)引物，此引物可将mRNA反转录成cDNA（又称为第1链），用5′端随机引物与cDNA第1条链互补进行PCR，随机扩增cDNA片段。将PCR产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，即可显示不同的条带位置，比较不同组间的显示结果，挑选差异条带，经回收再扩增，通过杂交验证、克隆测序。技术流程(1)提取两种细胞的mRNA,反转录后成为2种cDNA；(2)以随即引物和猫定引物作随机聚合酶链反应；(3)通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带；(4)将差异DNA做成探针，或设计特异引物；(5)在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析，或进行RT-PCR和RACE扩增基因。技术特点①简单，技术上仅仅依靠PCR和DNA测序胶电泳；②可以同时分析多组样品；③灵敏性高，仅需0.2μg总RNA作为起始材料，可检出低丰度mRNA；④实验周期短，约8d即可完成，便于重复；⑤最突出的优点是实验过（1）假阳性率高，假阳性的比例有时高达50％～75％。（2）由于某些序列的特异性，一些差异表达的转录不能得到分离，所以凝胶中的单条带可能由1种以上cDNA片段所构成。（3）差异显示所得的cDNA片段较短，长度多在100bp～400bp之间，且大多位于mRNA3′端约300bp的非翻译区（untranslatedregions,3′UTR）。cDNA-AFLP技术cDNA-AFLP（cDNA-amplifiedfragmentlengthpolymorphism）技术结合了RT-PCR和AFLP技术的分子标记技术。原理以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA。用识别序列分别为6-bp和4-bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段与人工接头连接后，利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示。技术流程（1）模板的制备和cDNA的合成；（2）双链cDNA片段的酶切和人工接头的连接；（3）酶切片段的预扩增和选择性扩增；（4）凝胶电泳；（5）比较处理组与对照组电泳图谱，找出差异条带；（6）回收差异条带，PCR富集，克隆；（7）测序，功能注释，然后进行基因的全长克隆。技术特点-需要的模板量少；-重复性好，假阳性低，可检测低丰度表达的mRNA；-准确反映基因间表达量的差别；-cDNA-AFLP不需要预先知道任何序列信息，且实验操作简便，可在任何实验室进行。适合对生物体转录组进行全面分析。抑制消减杂交（suppressionsubtractivehybridization，SSH）SSH即抑制消减杂交技术，是由Diatchenko等于1996年以mRNA差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。原理通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试（tester）cDNA片段的5’末端，将测试和驱动(driver)进行两轮杂交。标准化步骤均等了测试中的cDNA单链丰度，消减杂交步骤去除测试和驱动之间的共同序列。利用抑制性PCR选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA的扩增。因此，抑制性消减杂交技术显著增加了获得低丰度差异表达的cDNA的概率。技术流程1)测试材料：tester;对照材料：driver；2)cDNA合成：通过反转录获得cDNA；3）cDNA酶切；4)加接头（adapter），将testercDNA分成两组：tester1和tester2,一份与Adaptor1连接，另一份与Adaptor2连接（5’端）；5)第一次差减杂交,使连接一种接头的差异表达基因a初步富集；6)第二次差减杂交,形成了新的连接有两种接头的双链杂交片段,作为PCR指数扩增的模板；7）两轮PCR,特异扩增代表了差异表达的cDNA片段；8）将PCR所得的差别表达基因片段插入适当载体,转化细菌。经筛选,获得具有差异表达cDNA片段的阳性克隆。然后通过序列分析,可获得一些新的ESTs序列。技术特点（1）假阳性率大大降低；（2）高敏感性；（3）速度快，效率高；（4）SSH还具有背景低，重复性好的特点。应用抑制性消减杂交技术已经被广泛地应用于各种植物功能基因的克隆。RNA随机引物PCR指纹技术（arbitrarilyprimerPCRfingerprintingofRNA，RAP-PCR）RAP-PCR技术由WelshJ等1992年提出。它是以PCR为基础构建RNA指纹图谱,是研究基因差异表达的有效方法。原理以RNA为模板，在低严谨度条件下反转录产生cDNA第一链和第二链。随后用PCR扩增来富集产物,引物与反转录所用引物相同,在反应体系中用35S-dATP或32P-dCTP,进行放射性标记。经扩增后的产物在4%的测序胶上电泳,然后放射自显影。也可用非放射性标记如荧光标记、银染等方法。将不同样品,如同一品系不同组织的细胞或不同品系同一组织细胞的扩增产物作对照,可以将差异表达的微量mRNA放大,建立RNA群体的指纹图谱,在凝胶或X光片上显示出cDNA带谱的表型差异。技术流程1.制备组织；2.提取RNA；3.逆转录；4.PCR扩增；5.显示RNA指纹图谱；6.回收条带并扩增；7.克隆,测序；8.筛选cDNA文库,克隆差异表达基因。技术特点-方法简单-灵敏度高，能检测低丰度的差异表达基因-但该技术优势是建立在同位素的使用高通量测序技术高通量测序技术是可一次性对几十万到几百万条DNA分子进行并行测序的高效测序技术，近年来该技术被广泛地应用于全基因组分析,其中基因差异表达的转录组分析是基因分离克隆的快捷方法。高通量测序平台：A、SolexaHiSeq2000B、454GSFLXC、SOLiD5500xl利用高通量测序技术克隆基因步骤1）对两组材料（处理与对照）某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA进行测序，通过比较筛选出差异表达基因；2）半定量RT-PCR分析验证差异表达基因；3）通过过表达和RNAi鉴定克隆基因的功能。电子克隆电子克隆是建立在物种基因组测序和信息生物学技术基础上的一种基因快速克隆方法。原理利用基因数据库中基因片段，通过拼接获得全长序列，或通过基因差异表达分析获得基因片段的基础上，将其与该物种全基因组序列