营养缺陷型突变体的筛选及其应用

营养缺陷型突变体的筛选及其应用刘丹妹生物工程L081班E-mail：[e-mail]营养缺陷型突变体的筛选及其应用•主要内容：•一、营养缺陷型菌株的概念•二、培养基的类型•三、营养缺陷型菌株的筛选•四、营养缺陷型菌株的应用营养缺陷型菌株的概念•在诱变育种工作中，营养缺陷型突变体的筛选及应用有着十分重要的意义。•营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱基等)的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生长繁殖的变异菌株。培养基的类型•按其营养成分分类•基本培养基•完全培养基•补充培养基三种培养基的定义•凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分的合成培养基，称为基本培养(MM)。在这里我们称其变异前的菌株称为野生菌株。•在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白质、酵母膏等，能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基，称为完全培养基(CM)。三种培养基的定义•在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基，称为补充培养基(SM)。营养缺陷型菌株筛选的一般方法（1）诱变剂处理•（2）淘汰野生型菌株•①抗生素法•②菌丝过滤法•（3）检出营养缺陷型•（4）鉴定营养缺陷型营养缺陷型菌株的筛选过程•营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。•１诱变剂处理•诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的。２淘汰野生菌的方法•２．１抗生素法是利用野生型菌株能在MM中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于“休眠状态”，这时，加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。２淘汰野生菌的方法•２．２菌丝过滤法只适用于丝状真菌，其原理是在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再进行过滤。•如此重复数次后，就可以除去大部分野生型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的目的。３营养缺陷型的检出方法•具体方法：影印法、点种法、夹层法、限量补充培养法•夹层培养法•限量补充培养法•影印接种法•逐个检出法１）影印法•影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上，经培养后长出菌落，然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻按一下，转接到另一基本培养基平板上，经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。如果发现前一平扳上某一部位长有菌落，而在后一培养基上的相应部位却没有，就说明这是一个营养缺陷型菌落。２）夹层培养法•夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充培养基)，再培养，这时再出现的新菌落，多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。３）逐个检出法•逐个检出法是将经过诱变处理的细胞涂布在完全培养基平板上，待长出单个菌落后，用接种针或牙签将这些单个菌落逐个依次地分别接种到基本培养基和另一完全培养基平板上。经培养后，如果在完全培养基上长出菌落，而在基本培养基上却不长菌落，说明这是一个营养缺陷型菌株。４）限量补充培养法•限量补充培养法是将诱变处理后的细胞接种在含有微量(0.01％以下)蛋白胨的基本培养基上。野生型菌株就会迅速生长成较大的菌落，而营养缺陷型菌株只能形成生长缓慢的微小菌落，因而可以识别检出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，则可直接在基本培养基上加入微量的相应物质。营养缺陷型菌株的应用•其在研究和实践中都有极其重要的意义。它可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等遗传规律所不可缺少的标记菌种；也可作为氨基酸、维生素、碱基等物质生物测定的实验菌种；在生产中，可直接用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；也可作为菌种杂交、重组育种和利用基因工程进行育种时所不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株。