体内药物分析 手性药物HPLC法

1第10章手性药物的高效液相色谱拆分法空间结构不能重叠，互为镜像关系的立体异构体为对映体异构体，简称对映体（enantiomer），相应的药物称为手性药物。第一节、概述P2702偏振光和比旋光度光是一种电磁波，光波的振动方向与光的前进方向垂直。如果让光通过一个象栅栏一样的Nicol棱镜(起偏镜)就不是所有方向的光都能通过，而只有与棱镜晶轴方向平行的光才能通过。这样，透过棱晶的光就只能在一个方向上振动，象这种只在一个平面上振动的光，称为平面偏振光，简称偏振光或偏光。平面偏振光3那么，偏振光能否透过第二个Nicol棱镜(检偏镜)取决于两个棱镜的晶轴是否平行，平行则可透过；否则不能通过。如果在两个棱镜之间放一个盛液管，里面装入两种不同的物质：亮丙酸α亮暗乳酸4结论：物质有两类：（1）旋光性物质——能使偏振光振动面旋转的性质，叫做旋光性；具有旋光性的物质，叫做旋光性物质。（2）非旋光性物质——不具有旋光性的物质，叫做非旋光性物质。旋光性物质使偏振光旋转的角度，称为旋光度，以“”表示。其旋光方向顺时针右旋，以“d”或“+”表示。逆时针左旋，以“l”或“”表示。5旋光仪polarmeter：定量测量液体或溶液的旋光程度的仪器在有机化学中，凡是手性分子都具有旋光性，而非手性分子则没有旋光性。6C*不对称碳原子不对称碳原子:(asymmetriccarbonatom)与四个互不相同的基团相连的碳原子叫不对称碳原子C﹡.饱和碳原子具有四面体结构.(sp3杂化)7具有镜像与实物关系的一对旋光异构体。对映异构体CCOOHCH3HOHCCOOHCH3HOH(S)-(+)-乳酸(R)-(-)-乳酸()-乳酸mp53oCmp53oCmp18oC[]D=+3.82[]D=-3.82[]D=0pKa=3.79(25oC)pKa=3.83(25oC)pKa=3.86(25oC)151515外消旋乳酸比旋光度8对映体的命名R\S命名原则（1）按次序规则排出各取代基的顺序ABCDa.原子序数大小规则—序数大的原子优先b.同位素规则—原子量大优先c.外推规则—层层外推，先比较最大的d.相当规则—重键看作多个单键如：－ＨC=CＨ2等（2）方向盘法：最小基团D放在操作杆上，从D的对面看，顺时针为R,反时针为S.药物分子的手性标记通常采用R/S序列标记法。9手性药物的现状（现代药物分析选论，安登魁）手性药物（579）药物（1992）天然和半合成药物（556）合成药物（1436）非手性药物（857）单一异构体（73）外消旋体（506）手性药物（547）非手性药物（9）单一异构体（537）外消旋体（10）10同时，手性也是生物体系的基本特征。人体内糖的构型为D-构型，氨基酸为L-构型，因此，内源性的大分子物质如蛋白质、酶、载体、受体、糖蛋白、多糖、核酸等都具有手性特征。手性药物的作用机制：从立体化学角度看，手性药物的2个对映体实际上是2种完全不同的药物。它们通过与体内大分子的不同立体结合，可产生不同的吸收、分布、代谢和排泄过程，从而导致药物动力学参数的变化。由于手性药物的两个对映体的体内药动学过程不同，而可能具有不同的药理和毒理作用，甚至药效拮抗，也可能其中一个对映体导致了药物不良反应。？？？反应停不良反应？(S)-thalidomide致畸11手性药物的药理作用是通过与体内大分子之间的严格手性匹配与分子识别而实现的，也就是在人体内药物通过与具有特定物理形态的受体反应起作用。药物的两种立体异构体中，只有一种更适合与受体或活性部位结合，从而抑制（或激动）该大分子的生理活性，达到治疗的目的。药效12手性药物与生物体系相互作用具有立体选择性，可引起药理学差异，即药理学立体选择性。药理学立体选择性分为药效学立体选择性(stereoselectivityinpharmacodynamics)和药代动力学立体选择性(stereoselectivityinpharmacokine-tics)。宫丽综述13手性药物光学异构体的药理作用大致有以下5种类型：①一种光学异构体无治疗活性。②生物活性强度不同的光学异体。③生物活性强度相等的光学异构体。④生物活性类型不同的光学异构体。⑤生物活性相反的光学异构体。14反应停所引起的不良反应15NNHOOOO(S)-thalidomide致畸(R)-thalidomide镇静NNHOOOOFDA(U.S.Food&DrugAdministration)Topatentnewdrugsneedsfulldocumentationofthepharmacologicalprofilesoftheindividualenantiomersaswellastheircombinations.1984年荷兰药理学家Ariens极力提倡手性药物以单一对映体上市，抨击以消旋体形式进行药理研究以及上市。他的一系列论述的发表，引起药物部门广泛的重视。16美国FDA1992发布了手性药物指导原则。要求所有在美国上市的消旋体类新药，生产者均需提供报告，说明药物中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。欧共体国家及日本、加拿大等国随后也规定了类似的法规。2006年1月，我国SFDA也出台了相应的政策法规。这意味着化合物中如果存在一个手性中心，申请消旋药物时至少得做3组药理、临床数据，无疑研究费用和工作量相应加大。如果开发的是光学纯的手性药，只需做一组试验即可。随着拆分技术和不对称合成技术的发展，选择光学纯药物开发要更合算一些。17自从1992年美国FDA开始要求手性药物以来，手性药物在研发的新药中所占比例逐年增加，据市场统计1993年单一对映体药物的销售额为350亿美元，2000年全球销售额达到1330亿美元，预计2008年达到2000亿美元。手性药物以单纯对映体形式上市，可减少治疗总剂量，减少药物间相互作用，消除无活性对映体的毒性。合成手性药物的方法主要有化学合成法和生物合成法两种。18上世纪60年代初，科学家们开始研究在极少量的手性催化剂作用下获得大量的单旋体，这就是手性合成技术。最初只获得了3%的收率，经过近三十年的努力终于获得了成功。目前最高的产率已经接近100%，特别需要指出的是这种技术可以使人们随心所欲地合成自然界中不存在的左旋体或右旋体。比如除草剂Metolachlor，其左旋体具有非常高的除草性能，而右旋体不仅没有除草作用，而且具有致突变作用，每年有2000多万吨投放市场，其中1000多万吨是环境污染物。Metolachlor自1997年起以单旋体上市，10年间少向环境投放约1亿吨化学废物。19因此，若以消旋体药物给药，在研究药物对映体的药效、毒性及药动学性质时，应分别对单个光学异构体进行测定。如果采用传统、非立体选择性药物分析方法测定生物体液中药物对映体，以评价其药理行为，会得出不全面甚至错误的结论。所有这些都要求建立高专属性、高灵敏度、高分离度的对映体拆分和测定方法。20对映体化合物之间除了偏振光的偏转方向不同外，其他理化性质完全相同，因而在非手性环境中基本无法分离。创造手性环境，构造非对映异构体是实现手性拆分的基础色谱法分离手性药物对映体的方法有：间接法直接法手性固定相法CSP手性流动相法CMP创造手性环境构造非对映异构体21第二节手性分析的方法一、间接法又称柱前衍生化法，是药物对映体（不能说外消旋体）在用HPLC分离前，先与具有高光学纯度的手性衍生化试剂（CDR）反应，在药物对映体中引入第二个手性中心，形成非对映异构体，其理化性质就有较大的差异，因而可在普通固定相（非手性固定相）上实现分离（R）—SE+(R)—SA→(R)—SE—(R)—SA(S)—SA→(R)—SE—(S)—SA221.衍生化反应注意事项：（1）手性试剂必须是高光学纯度试剂，同时为了保证分析方法的准确性，衍生化反应需定量完成（90-100%）（2）手性待测物必需具有可反应的活泼基团如氨基、醇基、羧基，以保证与CDR反应完全。（3）手性试剂及反应产物在化学上和手性上都要稳定（4）所生成的非对映体在色谱分离时应有较高的柱效（5）在选择手性衍生化试剂时，应同时考虑使生成的非对映异构体具有良好的检测特性，故手性试剂应具有紫外或荧光等可检测基团。232.常用衍生化试剂的种类（1）异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯(IC)类此类试剂易与大多数醇类和胺类化合物反应，形成相应的氨基甲酸酯或脲的非对映体。如麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等。（2）萘衍生物类其结构特征有利于提高立体选择性，同时此类化合物具有很强的紫外吸收，用UV检测器可大大提高检测灵敏度，因此，萘的衍生物用作CDR十分普遍。24（3）羧酸衍生物类主要包括酰氯与磺酰氯类、酸酐类和率甲酸酯类。它们的手性碳位于羧基的α位，可与胺、氨基酸及醇类药物反应生成非对映异构体衍生物。（4）胺类主要用于衍生化羧酸类、N-保护氨基酸、醇类药物（5）测定体液中低浓度的药物对映体时，采用高灵敏度的荧光CDR25手性衍生化法的特点优点只需使用价格便宜、柱效较高的非手性柱衍生化可提高灵敏度缺点需要柱前衍生化，操作复杂衍生化试剂要求高的光学纯度衍生化反应速率重现性较差26柱前衍生化-反相高效液相色谱法拆分酮洛芬对映异构体S-()-酮洛芬R-(-)-酮洛芬27酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图＊＊S-萘乙胺28酮洛芬对映体的柱前衍生化方法酮洛芬对照品溶液(1mg/mL)0.1mL加入正己烷0.6mL二氯亚砜溶液0.2mL75℃1h冷却至室温吹干后加入S-NEA溶液0.2mL5min振摇加入2.0mol/LH2SO40.5mL混匀吹干后溶解进样二氯甲烷:乙醚2:129•色谱条件色谱柱：HypersilC18,5m,1505.0mmID，流动相：乙腈水-乙酸-三乙胺(55:45:0.1:0.02，v/v)，流速：1ml/min,检测波长：254nm30酮洛芬对映体衍生化物色谱图min2468101214mAu050100150200RS酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为tR=7.3min，tR=8.5min，分离度为1.931二、直接法是在HPLC系统中引入“手性识别器”或手性环境，以形成暂时的非对映异构体复合物，根据其形成复合物的稳定系数不同而获得分离。理论基础：Dalgliesh于1952年“三点相互作用”（three-pointinteraction)理论，在一对对映体和手性选择剂之间，为了形成稳定性不同的非对映体分子络合物而达到手性分离的目的，至少需要三个分子之间的相互作用部位，其作用力包括①氢键相互作用②包结络合作用③π-π电荷转移相互作用④立体契合作用⑤过渡金属离子的手性配位相互作用。32提供手性环境，通过手性识别进行分离33（一）手性流动相法CMP在流动相加入手性添加剂（CMPA），使其与待测物形成非对映异构体复合物，根据其形成复合物的稳定常数的不同而得以分离。直接法常用的手性添加剂环糊精添加剂手性离子对试剂配基交换型手性添加剂341.环糊精添加剂（一）手性流动相法CMPcyclodextrins，CD可分为α、β、γ三类，它们分别由6，7，8个D-吡喃葡萄糖通过α-1，4羟基连接。每个葡萄糖单元有5个手性碳原子。CD的手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂肪烃侧链的包容作用及环外壳上的羟基与药物对映体发生氢键作用。β-CD及其改性CD因具有最佳大小的内腔，因而广为使用352.手性离子对色谱法（一）手性流动相法CMP是一类用于分离可解离对映体的离子对色谱法，已成功分离了β-氨基醇类、氨基醇类、胺类等对映体化合物。常用手性反离子有奎尼，奎尼丁、10-樟脑磺酸等。3.配基交换型手性添加剂在流动相缓冲溶液中加入金属离子和配位体交换剂形成二元络合物，药物对映体再与其形成稳定性不同的三元络合物而达到手性分离。常用手性配基为光学活性氨基酸及其衍生物的二价金属离子螯合物。它们和手性药物形成非对映异构配位络合物对。36特点1.可采用普通的非手性固定相2.不需对样品进行衍生化3.手性添加物的可变范围较宽37β-环糊精手性