细胞工程课件

第四章细胞融合与体细胞杂交第一节细胞融合一细胞融合（1）细胞融合(cellfusion)：指用人工方法使两个或以上的细胞合并形成一个细胞的技术。（2）原生质体融合（protoplastfusion)：两种异源（种、属间）原生质体，在人工控制条件下，相互接触从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞的过程。异核体(heterokaryon)或异核细胞–基因型不同的原生质体融合成的杂交细胞同核体(homokaryon)–基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞非对称杂种或细胞质杂种（3）融合体类型一细胞融合（4）融合类型自发融合诱发融合对称融合（symmetricfusion）：两个完整的细胞间的融合非对称融合（asymmetricfusion）：核失活（X或r射线处理）非整倍体细胞质失活（丢失）Flash一细胞融合（5）融合步骤①亲本选择（单细胞或原生质体制备）②两原生质体或细胞互相靠近，粘附③质膜融合形成细胞桥④胞质渗透⑤细胞核融合⑥融合细胞筛选一细胞融合二、原生质体及其制备（1）定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体（protoplast）。（2）特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。具有全能性，能再生细胞壁（3）制备（4）分离、鉴定与活力分析1）分离飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。离心法：低速离心，收集沉淀。2）鉴定与活力分析低渗爆破：爆破后是无形的。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。染色发法：有活力的原生质体吸收不同染料显示与死亡细胞不同的颜色来分析。FDA（二乙酸荧光素）能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。三、诱导原生质体融合的方法生物法病毒诱导--仙台病毒较少使用化学融合(chemicalfusion)定义：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。主要种类：1.盐类融合法（NaNO3融合）2.高pH-高浓度钙离子融合法3.PEG融合法4.高pH-高浓度钙离子的PEG融合法化学法-1:NaNO3融合法机理：NaNO3能诱导原生质体融合的原因是钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进细胞融合。原生质体表面带有负电荷(在-10和-30mV之间)，同性质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足以融合的程度。融合率：0.1%~4%例子：Power（1970），玉米与燕麦原生质体融合化学法-2:高pH-高浓度钙离子融合法Keller和Melchers(1972，1974)首先发现高pH-高浓度钙离子的诱发融合效应。机理：钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合；高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。钙离子浓度和pH范围因植物种类不同而异。（例：烟草原生质体融合－－pH10.5，0.05mMCaCl2）化学法-3:PEG融合法诱导融合的机理PEG具有分子桥的作用：打破电荷平衡原生质体－水、蛋白质和碳水化合物－（氢键）PEG（氢键）－原生质体再经高浓度Ca2＋和高pH溶液处理并用培养液清洗，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连到另一种原生质体的带负电荷的基团上，导致原生质体融合。PEG融合技术的要点融合液配置A液：CaCl22~8mMKH2PO40.5~0.7mM甘露醇或山梨醇0.1~0.2mMPEG（分子量6000）25%~30%pH5.8B液：CaCl22~8mMKH2PO40.5~0.7mM甘露醇或山梨醇0.1~0.2mMpH7.0~10.0PEG融合技术的要点融合原生质体的密度和比例密度：1×105个/毫升比例：1:1融合融合原生质体溶液0.1~0.5ml，静置3～5min融合液A0.1~0.5ml，保持15~20min，25℃融合液B0.1~0.5ml，保持10~20min，25℃培养液洗涤（3～4次），离心（100×g，5min）化学法-4:高pH-高浓度钙离子的PEG融合法定义：利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。基本原理：在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。3电融合(electrofusion)3电融合(electrofusion)将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室微电极型平行多电极两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜表面接触，原生质体由于脉冲电流间断刺激，两层膜间产生小孔，连接成桥，经点连接到面连接，最后形成融合体。平行多电极通过1MHz交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。此时，加入直流电脉冲，质膜被击穿，进一步形成融合体PEG融合比较起来，电融合的优点：不存在对细胞的毒害问题融合效率高融合技术操作简便电融合参数（例：马铃薯，融合率40%）交变电场的振幅频率100V/cm交变电场处理时间20s支流高频电压1100V/cm脉冲宽度60us脉冲次数1四、影响原生质体融合的因素1.原生质体质量至关重要，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。2.融合方法3.融合参数，包括各种融合液都应选择适当。第二节体细胞杂交体细胞杂交体细胞杂交（somaticcellhybridization）：是指将不同来源的体细胞融合并使之分化再生、形成新品种的技术。体细胞杂交过程1.亲本选择（杂种细胞筛选标记）2.原生质体制备3.原生质体融合4.融合细胞筛选5.细胞壁再生6.细胞分裂形成细胞团7.愈伤组织8.植株再生及鉴定一、杂种细胞筛选（一）抗药性筛选（二）营养（代谢）互补筛选法（三）物理特性筛选法（四）荧光标记法（五）激素互补筛选法（二）营养互补筛选法根据其遗传和生理生化特性的互补选择法（三）物理特性筛选法根据可见标记性状的机械选择法形态、大小颜色（四）荧光标记法•。•FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显徽镜下呈绿色•RITC(异硫氰酸罗丹明)RITC在荧光显徽镜下呈红色（五）生长互补筛选法矮牵牛+爬山虎融合体的选择二、杂种植株鉴定（一）形态学鉴定根、茎、叶、花形态颜色（二）细胞学鉴定利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带型进行观察。根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。（三）同功酶鉴定（四）DNA分子标记鉴定是在DNA水平上对亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的一种技术。依据DNA的多态性（polymorphism）RandomAmplifiedPolymorphicDNA三、细胞质工程(cytoplasmicengineering)1.概念细胞质工程（细胞拆合工程）是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。2.细胞质工程的应用可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。3.概念：细胞质杂种应用细胞融合技术，使两种来源不同的核外遗传物质与一个特定的核基因组结合在一起4.细胞质杂种获得途径（4条）：（1）一个正常原生质体与一个去核原生质体融合；•Lorz等（1981）用密度梯度离心（5％~50%Percoll，20000~40000g，40~90min）获得高纯度的去核原生质体。（2）一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合使核失活的方法：X射线，碘乙酰胺，罗丹明（3）异核体形成后，两个核中有一个消失；（4）较晚时期，染色体选择性消失。四、体细胞杂种产生的其它途径1.细胞器移植（1）叶绿体移植•叶绿体的来源叶片－－－机械法－低速离心原生质体－低渗涨破－低速离心•叶绿体的纯化Percoll或蔗糖密度梯度离心•叶绿体的转移夹层离心法和PEG诱导融合应用PEG诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体，利用叶绿体的转移使低光效作物的原生质体通过摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。（2）细胞核移植•细胞核的来源植物组织－机械法（加TritonX-100）－过滤离心原生质体－低渗涨破(加TritonX-100)－过滤离心•细胞核的纯化Percoll或蔗糖密度梯度离心•细胞核的转移夹层离心法：原生质体－核－原生质体－核∙∙∙PEG诱导电场诱导和微注射2.2.微生物移植内吞作用摄入固氮根瘤菌3.外源染色体和DNA的摄入染色体分离细胞－同步化处理－原生质体－涨破－差速离心（200g,10min；1000g，20min）转移方法1.PEG诱导，显微注射2.农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔小结原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。体细胞杂交在远缘育种和新物种、新资源创造中具有深远意义。原生质体融合技术主要有PEG融合及电融合提高融合效率和融合细胞培养重复性是该技术研究的重点