生物工程下游技术第二讲 (动物细胞大规模培养和专用生物反应器)

上节课我们学了什么？问题生物反应器•生物反应器的一些概念•生物反应器的基本类型第二章动物细胞大规模培养和专用生物反应器•学时：2节课•主要内容：常用培养方法动物细胞培养的操作方式细胞培养过程的放大动物细胞培养生物放大器•动物细胞培养开始于上世纪初1962年,其规模逐渐扩大,发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法(生产酶、生长因子、疫苗和单抗等)。相关知识介绍利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。•发展：在过去几十年来，从使用转瓶(rollerbottle)、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器（Bioreactor）进行大规模细胞培养。•一是在工艺生产时不能大规模制备产品；•二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性•三是难以对同批生产进行生产和质量控制。第一代细胞培养技术核心问题：难以产业化！•随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，以便获得大量有用的细胞表达产物。•采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。•自70年代以来，较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器，中空纤维管反应器，无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。•80年代以来，人们逐渐开始以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。动物细胞大规模培养技术：（large-scaleculturetechnology）定义：指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞人二倍体细胞cho（中华仓鼠卵巢）细胞BHK-21(仓鼠肾细胞)Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等。可大规模培养的动物细胞口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗、α及β干扰素、血纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促红细胞素、松弛素、生长激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及200种单克隆抗体等。目前已实现商业化的产品：动物细胞生长特性：1.细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差3.需氧少，不耐受强力通风与搅拌4.群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）5.培养过程产品分布细胞内外，成本高6.原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡第一节常用的培养方法依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类：●贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。●非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。“贴壁单核”细胞培养贴壁的单核细胞贴壁细胞知识回顾动物细胞培养步骤培养动物细胞一般步骤：无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块将小组织块置解离液离散细胞。解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养大规模动物细胞培养工艺流程图细胞培养反应器提取细胞诱生剂细胞产品（肿瘤抗原）纯化产品（干扰素）纯化提取产品（单克隆抗体）浓缩纯化79865432110大规模培养动物细胞的方法：•贴壁培养•悬浮培养•固定化培养一、贴壁培养（attachmentculture）细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。1、生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。贴壁培养细胞转瓶机2、贴壁培养的优点：●容易更换培养液：细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。●适用于所有类型细胞。灌注培养3、贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比，●扩大培养比较困难，投资大；●占地面积大；●不能有效监测细胞的生长；4、细胞贴壁的表面：要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。5、贴壁培养系统：主要有转瓶、中空纤维（后面专题介绍）、玻璃珠、微载体系统（后面介绍）等。贴壁培养细胞转瓶机细胞转瓶培养器转瓶培养系统：为最初采用系统，一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。细胞接种在旋转的圆筒形培养器——转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气，从而提供较好的传质和传热条件。转瓶机转瓶培养的优、缺点优点：结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需简单的增加转瓶数量等。缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制等。二、悬浮培养（suspensionculture）指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等，是在微生物发酵的基础上发展起来的。小规模悬浮培养悬浮培养瓶•无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。三、固定化培养（immobilizationculture）：将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。上述两大类细胞都适用，具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易与产物分开，有利于产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微囊法等。1、吸附法:用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法（adhesion）。操作简便、条件温和、是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。缺点：载体的负荷能力低，细胞易脱落。微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表，稍后专门介绍。2、共价贴附法:利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法称为共价贴附法（attachmentbycovalentbonding）。此法可减少细胞的泄漏，但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。3、离子/共价交联法:双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞间形成桥而絮结产生交交联作用，此固定化细胞方法称为离子/共价交联法（cross-linkingbycovalentbonding）。交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。4、包埋法:将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包埋法（entrapment）。优点：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械剪切。缺点：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。石蜡切片中底部薄层软蜡包埋法甲基丙烯酸甲酯包埋标本微囊型包埋法5、微囊法（microencapsulation）:是用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。微囊直径控制在200-400μm为宜。第二节大规模培养技术的操作方式深层培养可分为:分批式流加式半连续式连续式连续式灌注式一、分批式培养（batchculture）较早期的方式，采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养一次性收获细胞、产物、培养基。特点:操作简单，培养周期短，染菌和细胞突变的风险小直观反映细胞生长代谢的过程。可直接放大。•细胞的生长分：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期五个阶段。•分批培养的周期多在3-5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗竭或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。二、流加式培养（feedingculture）细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。1、流加培养物的方式流加的时间通常在指数生长后期，细胞进入衰退期之前，添加高浓度的营养物质。可以添加一次，也可添加多次，凡是促细胞生长的物质均可以进行添加。流加的总体原则是维持细胞生长相对稳定的培养环境，营养成分既不过剩而产生大量的代谢副产物造成营养利用效率下降而成为无效的利用；也不缺乏导致细胞生长抑制或死亡。2、流加工艺中的营养成分（三大类）：●葡萄糖：供能物质、碳源物质，浓度较高则产生大量的代谢产物乳酸，因而需要控制浓度，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳。●谷氨酰胺：供能物质、氮源物质，需要控制浓度。大规模培养中细胞凋亡，谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因。●氨基酸、维生素及其他：必需氨基酸、非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆碱、生长刺激因子。●单一补料分批式培养:培养开始时投入一定量的基础培养液，培养到一定时期，开始连续补加浓缩营养物质，直到培养液体积达到生物反应器的最大操作容积，停止补加，最后将细胞培养液一次全部放出。●反复补料分批式培养:单一补料分批式操作的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分培养液，使培养液体积始终不超过反应器的最大操作容积，从而在理论上可以延长培养周期，直至培养效率下降，才将培养液全部放出。3、流加式培养类型：三、半连续式培养（semi-continuousculture）1、又称重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。2、半连续式特点：●培养物的体积逐步增加；●可进行多次收获；●细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。优点：操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。四、连续式培养（continuousculture）1、常见的悬浮培养模式：采用机械搅拌式生物反应器系统。在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基（防止衰退期出现）；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。2、连续式培养的特点：●细胞维持持续指数增长；●产物体积不断增长；●可控制衰退期与下降期。连续式培养3、优点：培养状态恒定，细胞在稳定状态下生长。稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。在稳定状态下细胞所处的环境条件可维持不变（如营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率）。细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响，特别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺，维持在一个较低的水平，从而使他们的利用效率提高，有害产物积累有所减少。4、不足：●由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染；●在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异；●对设备、仪器的控制技术要求较高。五、灌流式培养（perfusionculture）1、把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半