离体快繁与脱毒(28h)

努力学习，无论做什么都要尽你所能尽力而为。Studyhardandwhateveryoudo,doitaswellasyoupossiblecan.—卡尔·韦曼CarlWieman2001年诺贝尔物理学奖获得者植物细胞工程主讲教师：邵景侠TEL：13772546610E-mail：[e-mail]目录绪论（2h)第一章植物细胞工程实验室及基本操作技术（2h）第二章植物细胞工程原理概述(4h)第三章植物离体快繁技术和脱毒培养技术(4h)第四章植物细胞培养与有用物质生产(2h)第五章植物体细胞无性系变异与突变体筛选(2h)第六章植物离体单倍体诱导技术及应用(2h)第七章植物原生质体培养与体细胞杂交(2h)第八章植物胚胎培养技术及其应用(2h)第九章植物种质资源的离体保存(1h)第十章植物的遗传转化(1h)第三章植物离体快繁和脱毒培养技术•植物离体快速繁殖技术RapidMultiplication•植物的脱毒培养技术第一节、植物离体快速繁殖技术一、离体快速无性繁殖的概念及其意义二、植物离体快速无性繁殖的特点三、离体快速无性繁殖中器官的发生形式四、离体无性繁殖的程序五、植物组织培养中应注意的几个问题有性繁殖无性繁殖无融合生殖营养繁殖繁殖方式一、植物离体快速无性繁殖的概念及其意义1概念离体无性繁殖：指利用组织培养的方法进行植物离体培养，在短时间内获得大量遗传性一致的个体的方法，又称“离体繁殖，快速无性繁殖、微型繁殖”。试管苗：由离体无性繁殖获得的植株称试管苗。无性系：指有同一个体通过无性繁殖产生的一个群体，它们的遗传背景基本一致。2应用（1）用来加速难繁殖和繁殖速度慢的植物的繁殖。（2）无病毒苗木的繁殖。（3）用于某些杂合园艺植物的繁殖。（4）用于需要加速繁殖的特殊基因型。二、植物离体快速无性繁殖的特点1优点（1）首先体现在一个“快”字上。（2）可人为控制条件，不受大自然的干扰（3）快速培养脱毒苗。2局限性（1）一些植物快速无性繁殖技术的某些环节还没有突破。（2）要对其成本、技术等进行估算。（3）随继代次数增多，培养材料的分化能力下降。国内外植物离体快繁概况(1)欧洲微繁情况•植物组织培养室650多个•主产品为花卉、果树•微繁数量最大国家：荷兰、法国、意大利、比利时、英国。（2）美洲•微繁实验室200多个，1.57亿株/年•主要产品为香蕉、草莓、马铃薯脱毒种苗种薯。（3）亚洲•共有商业性实验室270多个•试管苗6500万株~9000万株/年•兰花、温带花卉、果树、农作物无性繁殖。国内外植物离体快繁概况（4）大洋洲•88个实验室•2000万试管苗/年•果树、农作物、林木、观赏植物（5）非洲•42个商业性组织培养室•80%微型繁殖，1.4×106株试管苗/年•农作物、马铃薯、木薯、甘蔗、香蕉国内外植物离体快繁概况国内基本情况•组培快繁种类：木本150种；花卉139种；药用53种；园艺（果蔬）29种；禾谷类44种；草本水果9种，共计445种。国内外植物离体快繁概况•发达国家：商业快繁，观赏植物，果树•发展中国家：育种研究，无性繁殖农作物三、离体无性繁殖中器官的发生形式1不定芽型（Adventitiousbudtype）２器官型（Organtype）３器官发生型（Oraneogenesis）４类胚体发生型（Embryogenesis）５原球茎型（Protocorm）1不定芽型不定芽：凡是叶腋或茎间以外任何其它地方形成的芽都称不定芽。外植体：要有明显顶端分生组织和次生分生组织的植物均适用。特点：以芽繁芽，繁殖速度快；后代遗传性比较稳定。（图）２器官型外植体：充分发育，生长旺盛的器官，如茎段、叶、花器、鳞片等。特点：直接从器官上诱导不定芽，遗传性比较稳定，但繁殖速度慢。３器官发生型外植体：生长幼嫩的材料，使其来源尽量一致，旺盛、新鲜的组织或器官。特点：繁殖速度快，但遗传性不稳定。４类胚体发生型即胚状体途径，由植物细胞、组织或器官直接诱导发生胚状体结构，最终发育成苗的方式。特点：遗传性稳定，但繁殖数量不如不定芽型和器官发生型多。从胡萝卜细胞培养产生胚状体和小植株开花结实的过程•用打孔器从胡萝卜块根上取得盘状外植体•外植体置于25℃下转动培养•由外植体分离出的细胞增殖并发育为胚状体•胚状体移于琼脂培养基上并长成植株和开花结实５原球茎型•兰花特有的原球茎发生型，通过诱导原球茎直接长成植株。•图：兰花原球茎发生型•图：兰花的微繁技术兰花的萌发兰花的启动兰花的增殖兰花的分化培养的兰花四、离体无性繁殖的程序•无菌母株的制备•茎芽的增殖•诱导生根•炼苗•再生植株的鉴定１无菌母株的制备（１）无菌母株的概念无菌母株：在无菌条件下，用于试管内继代增殖的植物材料，称为“无菌母株”或“繁殖母株”。（２）无菌培养物的建立外植体的制备（选择、清洗、消毒、灭菌）培养基的选择基本培养基无机营养水有机营养大量元素微量元素碳源氨基酸维生素附加成分植物激素生长素：IAA、IBA、NAA2，4-D细胞分裂素：ZT、KT、BA琼脂、聚蔗糖等天然有机复合物水解酪蛋白椰子乳汁马铃薯汁其它成分：AV、PVP、NaCl、完全培养基按培养基的用途分为：基本培养基诱导培养基继代培养基分化培养基生根培养基壮苗培养基按照培养基的物理状态分为：固体培养基半固体培养基液体培养基附加培养基单因子实验：第一组：1-1MS+BA0.0+NAA0.11-2MS+BA0.1+NAA0.11-3MS+BA0.2+NAA0.1第二组：2-1MS+BA0.1+NAA0.12-2MS+BA0.1+NAA0.22-3MS+BA0.1+NAA0.3………….２茎芽的增殖（１）通过不定芽的形成增殖（２）通过腋芽的形成增殖（图）蝴蝶兰花梗腋芽组织取芽法动画（３）通过单节茎段扦插增殖（图）繁殖速率的计算：•Y=mXn•Y：年繁殖数•M：无菌母株数•X：每个培养周期增殖的倍数•N：全年可增殖的周期次数３生根培养（１）试管内生根（２）试管外生根基质生根法嫁接生根法（１）试管内生根培养基内诱导生根的方法。调节激素种类和浓度调节基本培养基的组成（1/2、1/4MS）调节渗透压（降低糖浓度）调节激素种类和浓度•多数植物根分化需适当提高生长素水平，减低细胞分裂素水平。•有些植物在仅含生长素的培养基中即可诱导根分化。（如菊花在附加0.1-.3mg/LNAA培养基中，一周即可生根，生根率达100%。）•一些禾本科植物，在无激素条件下即可生根。（２）试管外生根基质生根法：把离体条件形成的无根小植株适当处理后，使其在基质中（蛭石、珍珠岩、土、沙子、泥炭等）生长（灭菌）。嫁接生根法：将无根小植株嫁接到砧木上，利用砧木的根系吸收养分和水分。试管内嫁接试管外嫁接４移栽（炼苗）（１）试管苗的特点根的特点叶的特点组织的特点根的特点根系生长不好，没有根毛或根毛很少，吸水力差，难以满足小苗蒸腾作用的消耗，小苗体内的水分难以达到平衡。叶的特点在高湿、弱光和异养条件下分化生长的叶，叶表皮保护组织不发达，甚至没有。无角质层、蜡质层，使叶片表面缺乏保护，易失水萎焉。组织的特点试管苗组织幼嫩，结构松散，细胞含水量大，机械组织不发达，容易发生机械损伤，对病虫害特别敏感。1.形态解剖方面（1）根（2）叶试管苗的特点（弱点）①叶的角质和蜡质层不发达，容易蒸腾失水。②无表皮毛，保水和反光能力差。③叶细胞结构疏松。④叶气孔突出，张大。⑤叶存在排水孔。（①无根毛②根与苗输导不相连。）①根的生理功能：低②叶片表面极易散失水分③气孔不能关闭④叶光和能力较低，CO2固定能力差。2.生理功能方面茎尖、腋芽花药单细胞原生质体愈伤组织胚状体芽分化完整再生植株再生植株驯化定植苗组织培养过程中4个阶段异养阶段半自养阶段半自养-自养阶段自养阶段（２）炼苗•瓶炼•盘炼（试管苗的出瓶移栽）•容器移栽•大田移栽在全自动培养间进行光照培养试管苗移栽于温室生根方法试管内生根（培养基）试管外生根影响试管内生根的因素•植物材料•培养基•植物激素•营养元素•其它物质（核黄素、活性碳）•培养条件•光照•pH•温度无菌异养高温弱光恒温试管苗的生长环境克服试管苗弱点，提高其移栽成活率的措施（1）移栽要抓三个关键①水分的平衡（不要失水过多）②温度和光照（不能太高）③光和能力逐步形成或加强（2）提高移栽成活率的技术措施①移栽前的工作②移栽时应注意的问题（1）培养瓶生壮苗移栽前的工作-1加入生长控制剂，如多效唑，B9，CCC，其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。（2）炼苗将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为10—30D。移栽前的工作-2移栽时应注意的问题（1）防止菌类滋生①苗底部培养基要洗干净②杀菌剂处理苗的根部③定时用杀菌剂处理种植基质常用杀菌剂：KMnO4,百菌清、多菌灵、托不津，使用浓度0.1％移栽时应注意的问题（2）保持小苗水分供给平衡(3)移栽时选择合理的种植基质基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭。移栽时应注意的问题泥炭珍珠岩椰糠移栽时应注意的问题一般强度较高的慢射光较好(4)注意一定光照，温度条件５试管苗的鉴定（１）形态学鉴定（２）细胞学鉴定五、植物组织培养中应注意的问题•褐变（褐化）•污染•玻璃化１褐变（１）褐变褐变：指在组织培养过程中，由培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。•褐变现象••褐变原因有的植物材料在接种后材料的表面出现褐色物质甚至培养基也呈褐色的现象，褐色会严重影响外植体的生长分化，成为植物组织培养的一大障碍。（组织中的多酚氧化酶被激活，使酚类物质被氧化生产生棕褐色醌类物质而引起褐变。）褐变影响因素•基因型•材料的生理状态•培养时间（２）克服褐变的方法选择适宜的外植体（幼嫩材料、春季取材）改善营养条件（连续培养）在培养基中加入一些附加物活性炭抗氧化剂ＶＣＰＶＰ（聚乙烯吡咯烷酮）ＢＳＡ（牛血清蛋白）褐变的防止三个选择分生能力强的外植体合适的无机盐成分浓度、合适的蔗糖浓度和激素水平适宜的温度两个加入（活性碳、抗氧化剂）一个连续（连续将材料进行转移）２污染细菌污染真菌污染污染细菌污染的特点•在培养材料附近出现黏液状菌斑，一般接种1-2天一5可发现。特别应注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌，外被荚膜，耐高温，一般灭菌剂难以杀死，可随培养材料、用具传播，可出现在培养基表面，也可呈滴形云雾状存在于培养基内，发现及时淘汰，并对用过的器具严格高温灭菌。真菌污染的特点•培养基上长霉，一般接种3-5天就可先，霉的颜色有黑、白、黄等，真菌污染的特点是污染部分有不同颜色的霉菌，接种3天，有时多达10天才能表现。（２）克服方法•外植体灭菌不彻底•培养基及各种器具清洁灭菌不彻底•人为因素•超净工作区被污染•环境不清洁细菌污染•表现：发酵状水渍状滴形云雾状•污染原因：培养基灭菌不过关接种器具污染操作污染交叉污染真菌污染•表现：•灰、白、黄、绿菌丝体、孢子组成绒毛状物有色圈•污染原因：•培养室湿度过大•瓶口积落有灰尘和孢子。材料内部带菌•在培养基中表现的症状外植体接触培养基部位长菌外植体损伤部位长菌外植体生长不良或表现出缺绿•诊断•培养基添加有机物检测人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培养皿：洗→热压玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干接种用具：用CCL4布擦→湿布擦→泡75%~95%酒精→烧培养基：湿热培养材料外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理内部细菌茎尖培养加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台用化学试剂薰蒸（甲醛或者甲醛：高锰酸钾=10:1)污染来源作好接种前准备•接种室的灭菌•超净工作台的灭菌•接种器皿、用具的灭菌•工作人员接种前应做的准备工作•材料的灭菌1.接种室的灭菌•接种室的地面，墙壁要擦洗干净•接种前一夜用甲醛熏蒸10ml/m2•接种室还可以采用紫外灯灭菌作好接种前准备2.超净工作台的灭菌•开风机前将紫外灯打开30分钟以上•