纳米药物载体入胞及转运

纳米药物载体入胞及转运——载体设计的机遇与挑战SeminarII学生：张德蒙导师：马小军研究员刘袖洞教授2012.12.13主要内容四展望一背景介绍二纳米药物入胞三纳米药物胞内转运一背景介绍1纳米药物尺寸：1-1000nm纳米药物纳米囊胶束无机纳米聚合物脂质体组成：载体+药物稳定性差弥补裸药缺陷靶向传递穿透生理屏障基因药物口服蛋白药物环孢菌素A紫杉醇难溶难渗药物缓、控释静脉给药2纳米药物传递系统纳米药物传递系统：控制药物释放时间及位点靶向传递一背景介绍时间：载体稳定性及与载体与药物结合紧密程度位点：载体胞外及胞内传递过程组织器官细胞亚细胞分子缓控释增强药效降低毒副作用入胞及胞内转运穿透生理屏障靶向传递的不同层次弥补裸药缺陷胞内释放一背景介绍胞外传递•RES、血管、胞外基质细胞传递A.T.Florence,JournalofControlledRelease,2012,164,115–1242纳米药物传递系统•聚集、扩散、流体力学特性•细胞膜：内吞•胞内转运、释放细胞内吞、转运机制研究不断完善，进步与争议并存纳米药物内吞、转运研究滞后二纳米药物入胞1内吞机制RuthDuncan,Mol.Pharmaceutics2012,9,2380−2402•清除细胞碎片、免疫监视•细胞间/胞内细胞通讯、神经传递•调节细胞表面受体及转运蛋白密度•重塑细胞外环境•细胞信号转导masterorganizer吞噬Celleating胞饮Celldrinking纳米材料聚集体调理素作用后的纳米粒1内吞机制(1)吞噬吞噬细胞(巨噬细胞、单核细胞、树突细胞)：血液清除纤维母细胞、内皮细胞(200nm-μm)细胞种类作用对象影响因素细胞种类纳米材料性质Carreno-GomezB.,DuncanR.,Int.J.Pharm.1997,148,231−240RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380−2402Militello,R.D.etal.Int.J.Pharm.1997,148,231−240B16-F10吞噬壳聚糖微球7.5μm纳米材料性质对胞吞的影响•尺寸与形状•表面性质200nm~μm，非关键与接触状态有关，研究较少1内吞机制(1)吞噬与调理素作用：亲疏水性、表面电荷与细胞作用：表面电荷、亲疏水性J.A.Champion,S.Mitragotri,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2006,103,4930–4934MilitelloR.D.,ColomboM.I.,Curr.Mol.Med.2011,11,197−203肺泡巨噬细胞与聚苯乙烯微球电荷密度调理素作用疏水性负电荷正电荷表面带电材料胞吞效率高于中性；疏水亲水网格蛋白介导内吞(CME)表面受体：LDLR、EGFR、TfR、Lectins配体修饰的纳米粒及病毒颗粒非特异性的电荷、亲疏水性作用引发胞吞效率较受体依赖型低1内吞机制(2)胞饮•最基本胞吞方式•研究最为透彻•动力蛋白依赖150nm100nm受体介导的CME非受体介导的CME：液相胞吞RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380−2402Herve’Hillaireau,PatrickCouvreur.Cell.Mol.LifeSci.2009,66,2873–2896•小窝蛋白排列瓶状膜结构，50-80nm•膜区富含胆固醇和鞘磷脂•上皮细胞含量最为丰富(10-20%)，平滑肌细胞、成纤维细胞含量同样丰富。•CvME胞吞速度比CME慢得多•配体介导：叶酸、白蛋白、胆固醇巨胞饮•肌动蛋白驱动•伸展的膜直接落回膜表面,1μm~5μm•未发现配体-受体选择性•参与纳米药物内化小窝介导内吞(CvME)1内吞机制(2)胞饮RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380−2402Herve’Hillaireau,PatrickCouvreur.Cell.Mol.LifeSci.2009,66,2873–2896纳米药物传递的影响研究仍处于很初级的阶段其他内吞方式1内吞机制(2)胞饮非网格蛋白/小窝蛋白依赖内吞方式•脂筏结构蛋白依赖的内吞与小窝介导内吞机理类似，40-50nm•Clathrin-independentcarrier/GPI-AP-enrichedearlyendosomalcompartment•Interleukin2receptorbpathway,orRhoA-dependentuptakeRuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380−2402Tore-GeirIversen,etal.NanoToday,2011,6,176—185肌动蛋白、微管蛋白二纳米药物入胞2内吞机制定量M.Koivusalo,C.Welch,etal.J.CellBiol.2010,188,547—563L.Pelkmans,D.Puntener,etal.Science,2002,296,535—539H.Y.Nametal.JournalofControlledRelease135(2009)259–267判断纳米药物入胞的途径：胞吞抑制剂内吞机制非独立•内吞转运有关的分子包被蛋白、衔接子、分离蛋白，RabGTP酶（60多种）•内吞转运依赖的细胞骨架抑制剂非专一性继续努力药物受抑制内吞通路简单原理阿米洛利(Amiloride,或EIPA/HOE-694)巨胞饮降低膜表面pH阻断Rac1/Cdc42信号传递细胞松弛素D(CytochalasinD)actin聚合抑制剂氯丙嗪(Chlorpromazine)CMERhoGTPase抑制剂DynasoreCME、吞噬作用、小窝胞吞等动力蛋白依赖机制动力蛋白抑制剂菲律宾素(Filipin)、Nystatin、LovostatinCvME、脂筏胞吞等于胆固醇相关入胞机制与胆固醇作用或干扰其代谢染料木素(Genistein)CvME酪氨酸激酶抑制剂，阻断小窝形成Cy5.5-疏水性修饰乙二醇壳聚糖纳米粒(HGC)CMECvMEMPT二纳米药物入胞细胞方面极性细胞：基底端与顶端胞吞机制不同细胞种类：影响最大细胞状态：密度、细胞周期、代谢及胞外基质的变化3内吞过程影响因素内吞相关物质种类繁多，信号转导通路复杂ZaunerW,FarrowNA,HainesAMR,JControlRelease,2001,71,39-51不同细胞、不同状态对不同粒径纳米粒胞吞结果形状：研究处于初级阶段，影响因素较多且难以区分•尺寸与形状聚苯乙烯颗粒胞饮200nm吞噬、巨胞饮StephanieE.A.Gratton,etal.,BioconjugateChem.,2010,21,797-8023内吞过程影响因素纳米载体方面•载体表面性质与负电性细胞膜作用，荷正电粒子更易与细胞膜吸附并完成内吞电位10~25mV，但并不绝对。Harush-FrenkelO,DebottonN,BiochemBiophysResCommun,2007,353,26-32ZhangLW,Monteiro-RiviereNA,ToxicologicalSciences,2009,110,138-155HeLaPEG-PLAE.Garcia-Garciaetal.,CMLS,Cell.Mol.LifeSci.2005,62,1400-1408表面修饰PEG，增强胞吞(受体作用，提高血液循环时间)3内吞过程影响因素a.表面电荷b.亲疏水性：c.靶向配基HeeDongHan,etal.,ClinCancerRes,2010,16,3910-3922小分子(叶酸)、蛋白(Tr)、CPP(RGD)靶向配体密度不可控、肿瘤细胞异质性受体内化率低、受体表达下调临床效果有限QD655QD655-NH2QD655-COOH2nM20nM人肾胚胎(HEK)细胞3内吞过程影响因素纳米药物主动靶向I.K.Kwonetal.JournalofControlledRelease,2012,164,108–114D.B.Kirpotin,etal,CancerRes,2006,66,6732–6740小鼠肿瘤中脂质体变化细胞实验anti-HER2•Cetuximab、trastuzumab、EC0489、EC0145疗效改善源于EPR效应的被动靶向或局部给药体外:药物-细胞无障碍药物高浓度细胞受体表达稳定体内：？RES系统靶向：17%达到肝脏其他部位靶向：药物累积0.01%•HPMAcopolymer−doxorubicin−galactose唾液酸糖蛋白受体M.deSmet,etal.J.Control.Release,2011,150102–110I.K.Kwonetal.JournalofControlledRelease,2012,164,108–114RES(脾、肝、肺)捕获无动力，自由扩散血液中药物释放平面细胞与体内细胞受体表达差异？时间&密度受体饱和与循环时间差异？细胞外基质等细胞外环境变化？3内吞过程影响因素纳米药物主动靶向血液循环靶向修饰脂质体血液药物释放细胞层紧密程度对药物扩散的影响三纳米药物胞内转运转运过程由入胞方决定，胞吞物或经转运过程重新排出胞外，或进入溶酶体消化降解1纳米药物胞内转运路径Tore-GeirIversen,etal.NanoToday,2011,6,176—185P.Gonnordetal.SeminarsinCell&DevelopmentalBiology,2012,23,154-164早期内体(EE)约5min到达，pH6.5胞吞物与受体分离材料分选：循环或者代谢通路内含蛋白与循环受体Rab5EarlyEndosomalAntigen1(EEA1)Transferrinreceptor(TfR)循环内体(RE)约30min到达，30-60min内循环至细胞质膜包含循环材料的网状结构Rab11Transferrinreceptor(TfR)晚期内体(LE)60min后到达，pH6.0甘露糖-6-磷酸受体(M6PR)介导高尔基体分泌的溶酶体小泡不断融合含有高度糖基化的溶酶体膜相关蛋白(LAMPs)含有内在膜，多泡体M6PRRab7LAMPs1-3Rab7溶酶体(LYS)pH4.5-5.5与胞吞物降解及细胞自噬密切相关，包含60多种溶酶体酶LAMPs组织蛋白酶D(cathepsinD)细胞器特征Marker2参与转运的主要细胞器三纳米药物胞内转运RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380−2402P.Gonnordetal.,SeminarsinCell&DevelopmentalBiology,2012,23,154-164三纳米药物胞内转运3转运过程监测方法Q.O.Garred,etal.Traffic2,2001,2,26-36SternST,etal,Tox.Sci.2008,106,140–152透射电镜细胞器Marker荧光标记形态学判断细胞器位置及形态细胞间差异较大样品处理对形态的影响分辨率限制：高分辨荧光成像技术内化标记物动态移动细胞器Marker非专一性目标荧光与细胞器荧光融合专一高效Marker验证Au溶菌酶QD猪肾细胞三纳米药物胞内转运4转运过程的调控了解纳米药物转运机制，寻求实现最佳药效的的转运方式内吞决定转运的例外•病原体(分支杆菌、沙门氏菌等)扰乱转运避免进入LYS降解降低免疫识别的可能性•内皮生长因子受体(EGFR)复合物泛素化•海参毒素、蓖麻毒素多途径内吞，转运过程相同泛素化标记：降解通路去泛素化标记：循环通路•极性细胞入胞方式相同，转运路径不同阐明转运过程变化机制，有助于纳米药物胞内定向传递Sandvig,K.,etal.,FEBSLett.,2010,584,2626−2634分子量100