制药分离工程-第五章反胶团萃取与双水相萃取

LOGO制药分离工程主讲：程纯儒第五章反胶团萃取与双水相萃取反胶团萃取双水相萃取21反胶团萃取技术发展背景：随着生物工程的发展，传统的溶剂萃取方法难以应用于一些生物活性物质（如蛋白质）的提取和分离。急需研究和开发易于工业化的、高效的生化物质分离方法。反胶团萃取（reversedmicellarextraction)P72页英文单词错误。反胶团萃取1977年，瑞士学者Luisi等人首次提出用反胶团萃取蛋白质，但并未引起人们的广泛注意。20世纪80年代，生物学家们才开始认识到反胶团萃取的重要性。反胶团萃取胶团（micelles):将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶团浓度时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起形成聚集体，称为胶团。水溶液中胶团的非极性基团在内，而极性基团在外。反胶团（reversedmicelles):将表面活性剂溶于有机溶剂中，当其浓度超过临界胶团浓度时，表面活性剂就会在有机溶液中聚集在一起形成聚集体，称为反胶团。有机溶液中胶团的非极性基团在外，而极性基团在内。反胶团萃取在反胶团中，极性基团排列在内，形成一个极性核，溶解水后，就形成“水池”，起保护作用，使蛋白质不失活。反胶团萃取常用的表面活性剂：阴离子表面活性剂：丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠阳离子表面活性剂：溴化十六烷基三甲胺，溴化十二烷基二甲胺，氯化三辛基甲胺反胶团萃取丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠（AOT),最常用，原因：1.易于获得2.具有双链，极性基团小，形成反胶团时，不需要加入助表面活性剂3.形成的反胶团半径较大，有利于大分子蛋白的进入反胶团萃取反胶团的形状和大小反胶团的形状多为球形或近似球形，有时也呈柱状结构。半径：一般10-100nm,取决于盐的种类和浓度、溶剂、表面活性剂的种类和浓度以及温度。W0=[水]/[表面活性剂]反胶团萃取水池的性质：水池提供亲水微环境，可溶解氨基酸、肽、蛋白质等。当含水率较低时，“水池”内水的理化性质相差悬殊。W0小于6-8时，池中水的表观黏度上升50倍，疏水性也极高。由于有较高的电荷浓度，“水池”中水的pH值不同于主体的pH。反胶团萃取反胶团萃取蛋白质的过程：蛋白质进入反胶团溶液是一种协同过程。表面活性剂同临近蛋白质发生静电作用而变形---》在两相界面形成反胶团----》扩散到有机相中。----》改变pH,离子种类、强度等，可使蛋白质由有机相重新返回水相，实现反萃取过程。反胶团萃取蛋白质溶入反胶团的推动力：1.静电作用力（最直接的因素是pH值,与等电点PI）。2.空间位阻效应（水池的大小和形状）。反胶团萃取影响反胶团萃取蛋白质的主要因素：1.与反胶团有关的因素：表面活性剂种类、浓度，有机溶剂种类，助表面活性剂及其浓度2.与水相有关的因素：pH值，离子的种类，离子的强度3.与目标蛋白质有关因素：蛋白质的等电点、大小、浓度、表面电荷分布4.与环境有关的因素：系统的温度、压力双水相萃取双水相系统：因两种水溶性聚合物的水溶液，或一种水溶性聚合物水溶液与盐溶液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统特点：两相均含有大量的水（高达80%以上），界面张力小，一般只有0.5-10-4mN/m，萃取环境和条件温和，生物相容性好，有时有稳定作用；分配系数可控：聚合物修饰、相系统组成、操作条件容易放大，几百倍。双水相萃取发展历史1896年荷兰微生物学家Berjerinck发现琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合时形成双水相现象。1956年瑞典lund大学的Albertsson教授及其同事开始对双水相系统进行比较系统研究。测定了许多双水相系统的相图，考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在双水相中的分配行为，为双水相萃取系统的发展奠定了基础。只局限于实验室内的测定和理论研究。双水相萃取发展历史Kula教授研究小组对双水相的应用、工艺流程、操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研究，在应用上获得成功。1978年首先将双水相萃取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工业装置，达到20kg/h的处理能力，分离纯化了几十种酶，也应用于基因工程产品的分离。双水相萃取可分离多肽、蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织，以及重金属离子等，近年来，还应用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。作为反应系统用于酶反应，生物转化，发酵的产物生产与分离的集成。双水相萃取1.双水相系统含较高浓度的水溶性聚合物和盐，会带到产物中，去除需要辅助处理方法。2.成本较高。即使水溶性聚合物和盐尽管回收再用。3.选择性较低，分离纯化倍数低，一般只适用于粗分离。双水相萃取聚丙二醇(PPG)聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚蔗糖(Ficoll)羟丙基葡聚糖A聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚乙烯吡咯烷酮B硫酸葡聚糖酸钠羧甲基葡聚糖酸钠聚丙烯乙二醇甲基纤维素C羧甲基葡聚糖酸钠羧甲基纤维素钠盐D聚乙二醇硫酸钾，硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁，磷酸盐酒石酸钠琥珀酸钠，柠檬酸纳E聚乙二醇葡聚糖乙二醇单丁酯丙醇A,两者均为非离子性聚合物,B,一种非离子性聚合物，另一种为带电荷的聚电解质C,两者均为聚电解质,D,一种聚合物，另一种为盐。E,一种聚合物，另一种为有机小分子双水相萃取1.能够获得高的产物回收和生物活性回收，高的分离纯化倍数；2.系统的物理化学性质有利于大规模的应用，有良好的工艺性能，系统黏度低，相分离快，达到相平衡时间短，工艺参数容易控制，工艺条件可调性范围大；3.系统经济，成本低，无毒，适合大规模应用。选择双水相的原则双水相萃取分配系数一种物质在两相系统中的分配行为可用分配系数来描述，分配系数K为该物质在上相和下相中的浓度之比。此处cT和cB分别为上相和下相中的目的物质浓度。当目的物质主要分配在上相时，分配系数K值大于1，并随在上相中浓度的增加而增加；反之，目的物质主要分配在下相时，分配系数K值会小于1，并随在下相浓度的增加而减小。控制能够影响物质分配系数K的因素，包括环境因素，相系统性质和组成就可以改变物质的分配系数。BTccK双水相萃取普通双水相萃取是指主要依靠空间位阻分配和界面电位分配的双水相萃取，如利用聚合物/聚合物系统和聚合物/盐系统的萃取，它们发展最早，也是研究最多和应用最多的双水相系统，也是其它分配萃取系统的基础。为了改进萃取效率和分离效果，利用控制相系统的pH或在相系统中加入盐或有机溶剂的方法提高目的物的分配系数。普通的双水相萃取系统的选择性比较低，只适用于产物回收和初步分离。双水相萃取影响分配的因素表面自由能的影响分子或颗粒在溶液中的分配，总是选择到能量最低的哪个相。双水相萃取影响分配的因素液体的表面张力大小与液体性质，如溶剂和溶质的性质、浓度、黏度、另一相性质、温度、压力等有密切关系，这些因素的变化均造成分配系数K的变化。双水相萃取在两相系统中若有盐存在，会对大分子在两相中的分配产生较大的影响，通常称为盐效应。盐浓度对K值的影响01234567800.10.20.3磷酸钾（M）K值○普鲁兰酶，9%PEG4000/1.25%DexT500,pH7.8□富马酸脱氢酶，9%PEG4000/2%DexT500,pH7.5●甲醛脱氢酶，9%PEG4000/2%DexT500,pH7.5△1,4-葡萄糖磷酸化酶，7.2%PEG4000/6.7%DexT500,pH7.5双水相萃取-2.4-1.8-1.2-0.600.61.21.80200040006000PEG分子量logKPEG分子量和KCl对K值的影响氯化钾和PEG分子量对甲酸脱氢酶的分配系数的影响◆2.5MKCl■无KCl系统：15%PEG/15%磷酸钾（pH7.8）双水相萃取系统pH的影响相系统的pH不仅直接影响相系统中的蛋白质，也同样影响系统中盐，即影响它们解离度和离子的电荷性质及数量，以及各种离子的比例，如H2PO4-和HPO42-，HSO4-和SO42-，NH3和NH4+。进而影响界面电位U2-U1，对蛋白质的分配系数产生强烈的影响。通常pH的微小变化就会引起蛋白质分配系数发生2～3数量级的变化。双水相萃取00.20.40.60.866.577.588.59pHKpH对磷酸化酶的分配系数的影响相系统：7.2%PEG4000/6.7%DexT500,200mM缓冲液◆PO43-■Tris在PEG/Dex系统中，当使用Tris缓冲液时，在pH7-8.5范围内，不会使缓冲离子的电荷发生改变，对酶的分配系数影响不大；而在使用磷酸盐缓冲液时，改变pH对缓冲离子的电荷数及其不同离子的比例影响很大，而时酶分配系数的发生明显改变。双水相萃取温度对分配系数的影响温度主要影响两相系统的形成，随着温度的降低，分相的临界聚合物浓度减小，所以在临界点附近，温度对酶的分配系数影响较大，而在远离临界点时，影响较小；在相组成一定时，温度的降低会使相图的结点线增长，两相差异增大，可引起分配系数的下降。使用PEG/(NH4)2SO4相系统从细菌中萃取荧光素酶时，温度对分配系数的影响不明显。双水相萃取通常酶的稳定性会随温度的增高而减低，但在双水相系统中，由于所使用的聚合物含有多羟基，对酶有保护作用，即使在室温下，酶的失活也不明显。因此酶的双水相萃取可以在室温下进行，这可以节省因冷却造成的大量能摹。双水相萃取双水相萃取技术主要应用于粗酶提取与回收，也可用于对纯度要求不高的酶制剂的生产。如果使用具有高度选择性的亲和萃取技术也可以生产一些纯度较高的酶制剂，如试剂用酶。因为对试剂用酶的纯度要求并很不高，只要没有干扰测定的其他酶就可以使用。应用双水相萃取双水相系统萃取酶的一般流程图双水相萃取LOGOThankYou!