Northern-Blot印迹杂交

NorthernBlot湖南师范大学生命科学学院刘如石博士/副教授一、实验目的：1、掌握Northernblot的实验原理与操作技术；2、了解Northernblot的实验在分子生物学与转基因领域的应用。二、实验原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，然后将分离的RNA转移到尼龙膜，然后用放射性标记的探针进行杂交检测，最后进行放射性自显影。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。三、实验材料1、仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。2、材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25ng)，尼龙膜3、试剂NorthernMaxKit（Cat.#1940，Ambion,Inc.），琼脂糖，DEPC,X光底片，底片暗盒，RandomPrimer，dNTPMixture，111TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-freeKlenowFragment和10XBuffer,SephadexG-50,SDS，双氧水,灭菌水等。四、实验步骤1.用具的准备：180度烤三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4h；清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水冲洗，干燥备用；处理DEPC水(2L)备用2．RNAZaP去除用具表面的RNase污染，用RNAZap擦洗梳子、电泳槽、刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。3．制胶：①称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)②加入3.6ml10×DenaturingGelbuffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。③将熔胶倒入制胶板中，插上梳子。注：胶的厚度不能超过0.5cm。④胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1×MOPSGelRunningbuffer盖过胶面约1cm。⑤检查点样孔。4.RNA样品的制备：在RNA样品中加入3倍体积的formaldehydeloaddye和适当的EB。混匀后，65℃15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。5.电泳：将RNA样品小心加到点样孔中，5V/cm下进行电泳（在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳），当胶中的溴纷蓝接近胶的边缘时终止电泳；紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离（注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间）。6.转膜：①用3%双氧水浸泡真空转移仪，用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。②连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜，在Transferbuffer浸湿5min后，放置在多孔渗水屏的适当位置。③盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁，将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。④将胶小心放置在膜上，膜与胶间不能有气泡。7．打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transferbuffer加到胶面和四周。每隔10min在胶上加1mltransferbuffer，转移2h。8．转膜后将膜于1×MOPSGelRunningbuffer中轻轻泡洗10sec（去残余胶和盐）。9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)。11．将膜在-20℃保存。12.探针的制备：①在1.5ml离心管中配制以下反应液：模板DNA(25ng)1μl；RandomPrimer2μl；灭菌水11μl；总体积：14μl。②95℃加热3min后，迅速放置于冰冷却5min。③在离心管中按下列顺序加入以下溶液：10×Buffer2.5μldNTPMixture2.5μl111TBq/mmol[a-32P]dCTP5μlExo-freeKlenowFragment1μl混匀后（25ul），37℃下反应30min。短暂离心，收集溶液到管底。④65℃加热5min使酶失活。13.探针的纯化及比活性测定：①准备凝胶：将1g凝胶加入30mlDEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配的TE(pH7.6)。②取1ml的注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填12SephadexG-50。③将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4min，凝胶压紧后，补加SephadexG-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处。④100μlSTE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。⑤倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于15ml管中，再将装填了SephadexG-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。⑥将标记的DNA样品加入25μlSTE，取出0.5μl点样于DE8-paper上，其余上样于层析柱上。⑦1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5μl己纯化的探针点样于DE8-paper⑧测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml）。14．预杂交：①将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。②加入适量的ULRAhyb到杂交管中(100cm2加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4h。15．探针变性：①用10mMEDTA将探针稀释10倍。②90℃热处理稀释后探针10min，立即放置于冰上5min。③短暂离心，将溶液收集到管底。16．杂交：①加入0.5mlULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。②42℃杂交过夜（14~24h），杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。17．洗膜：加入HighStringencyWashSolution2(100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃摇动洗膜20min两次。18．曝光：将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥；检查膜上放射性强度，估计曝光时间，将X光底片覆盖与膜上，曝光后冲洗X光底片，扫描记录结果。19．去除膜上的探针：将200ml0.1%SDS（DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。20．杂交结果五、结果与分析：THANKYOU!