分子杂交及生物芯片技术

厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交及生物芯片技术申川军广州中医药大学生物化学教研室厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术参考书屈伸刘志国厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术目录第一章生物大分子制备和分析常用技术第二章蛋白质、核酸的提取与分离第三章PCR技术第四章分子杂交与印迹技术第五章分子克隆技术第六章外源基因转移技术第七章蛋白质表达技术第八章分子标技术第九章分子改造技术第十章测序及人工合成技术第十一章基因组学技术第十二章蛋白质组学技术第十三章生物芯片技术第十四章生物信息学技术厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术参考书马文丽郑文岭彭翼飞厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术目录第一章核酸的分子结构与分子杂交的基本原理第二章核酸分子杂交的类型第一节固相核酸分子杂交类型一、菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）二、斑点杂交（dotblot）三、southern印迹杂交（southernblot）四、northern印迹杂交（northernblot）五、组织原位杂交（tissueinsituhybridization）第三章核酸探针的种类、标记及检测第一节核酸探针的种类dna探针cdna探针rna探针寡核苷酸探针第二节核酸探针的标记和检测放射性同位素非放射性核酸探针第四章核酸分子杂交实验因素的优化探针选择标记方法浓度杂交率杂交最适温度杂交的严格性反应时间杂交促进剂第五章斑点杂交厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术第六章southern印迹杂交第一节southern印迹杂交的基本原理一、dna从凝胶到膜上的转移方法二、southern杂交膜三、核酸探针的标记第二节southern印迹法的基本过程一、dna样品的酶切和电泳二、准备用于转移的凝胶三、dna从琼脂糖凝胶转移到固相支持物四、探针标记五、杂交六、洗膜七、杂交结果的检测八、杂交膜的重复使用九、注意事项十、杂交严谨性第七章northern印迹杂交第八章原位杂交第九章菌落原位杂交第十章dna芯片技术厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术基本概念变性/复性：分子杂交：异源互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为分子杂交。分子杂交技术：凝胶电泳分离待测DNA、RNA、Pr并转移固定到支持物或结合物上，然后与探针/抗体杂交分析。探针(Probe)：已知序列的标记单链核酸片断，用于检测与其互补的待测核酸。厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术基本概念原位杂交（Insituhybridization,ISH）：菌落原位杂交(ColonyISH)组织原位杂交(TissueISH)：胚胎原位杂交(EmbryoISH)：斑点/狭缝杂交(Dot/slotblot)：厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术基本概念Bio-chip（生物芯片）DNAchip/microarrayGenechip/microarrayOligonucleotidemicroarraycDNAchipProteinchipmicroRNAchipLab-on-chip（芯片实验室）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术生物大分子的印迹杂交技术厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术定义：凝胶电泳分离待测DNA、RNA、Pr并转移固定到结合物上，然后与探针/抗体杂交分析原理：核酸变复性（序列互补）/抗原-抗体基本工艺：凝胶电泳（原位处理）样品转移及固定杂交分析（免疫结合分析）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术1969，Insituhybridization（ISH）1975，Southern，Southernblot:DNA1977，Alwine，Northernblot：RNA1979，Towbin，Westernblot：Pr1982，Reinher，Easternblot：Pr(IEF)厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术---探针探针基本条件（特点）标记物（32p,35S,125I,Digoxigenin,FITC）单链核酸（ssDNA，sscDNA(更常用)）高特异性（~500bp）标记物稳定灵敏，检测方便安全厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术---探针探针的种类DNAprobe（基因copy数、病原基因诊断）cDNAprobe（基因表达等最常用）RNAprobe（ISH）Oligonuleotide-probe（25~50bp；基因诊断，SNP分析、测序、点突变检测）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术---探针探针标记物放射性标记物（[α-*N]-dNTP）32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)非放射性标记物半抗原：生物素、地高辛荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术---探针-32P-dNTP结构A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHOOOHHHHOCH2厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术---探针厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术---探针探针标记随机引物法缺口平移法(DNaseIandDNA聚合酶I)末端标记法碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶[γ-32p]-ATP标记DNA/RNA-5′末端转移酶（poly(N*)n）T4DNA聚合酶/Klenow片断（粘末端补平）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术---探针探针纯化乙醇沉淀法凝胶过滤法（G-50Spincolumn）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术—印迹印迹（转膜）支持物：硝酸纤维素膜（NC膜）尼龙膜N+-nylon（DNA/RNA）中性膜PVDF膜（westernblot）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术—印迹印迹（转膜）方法：毛细管虹吸转移法真空转移法电转移法厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术—印迹湿滤纸缓冲液滤纸桥凝胶硝酸纤维素膜吸水纸玻璃板支持台容器重物毛细管虹吸转移法厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术—印迹尼龙膜凝胶滤纸海绵凝胶支持夹缓冲液电极+–滤纸电极电转移法厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术—印迹真空转移法-1h厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术—印迹真空转移装置厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术—印迹Westernblot(SDS-PAGE及转膜系统)厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术—影响因素离子强度(高-消除静电斥力-利于杂交)温度（低于Tm20-25℃）有机试剂（去离子甲酰胺）-降低Tm样品/探针分子的大小和复杂程度洗涤条件（高严谨性，洗去非特异性结合探针）支持物添加物（吸附DNA探针，使DNA接触面增大）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术#预杂交为减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭。变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术—基本流程样品及探针制备样品电泳分离转膜预杂交杂交洗膜分析（压片、显色、荧光观察等）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术SouthernblotDNA提取酶切电泳/拍照转膜/固定探针制备预杂交杂交洗膜扫磷屏厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术---UV交联仪多用途254nm紫外辐射系统，主要用于将核酸交联于膜上。还用于琼脂凝胶中DNA的切割，RecA突变筛选，胸腺二聚体产生的部分限制性内切酶消化，UV灭菌消除PCR污染。另紫外灭菌-聚合物紫外处理。厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术Southernblot应用DNA多态性分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD）基因突变检测基因copy数检测重组子筛选DNA指纹分析测序厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术Southernblot应用DNA指纹分析血迹中的DNA厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术Northernblot基因表达分析mRNA长度及半定量分析RNA分子（TRIzol）甲醛变性电泳至膜上转膜杂交、显影凝胶滤膜用10xSSC转移RNA吸附有RNA片段的膜（亚甲蓝染色）带有RNA片段的凝胶厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术Westernblot蛋白提取/样品准备SDS-PAGE电转/丽春红S染色封闭一抗孵育洗涤一抗二抗孵育洗膜结果观察/显色（Dig-AP/FITC）组织蛋白厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术ISH胚胎/组织制备固定消化/再固定/洗涤RNA探针制备封闭杂交/洗涤一抗/洗涤二抗/洗涤显色(Dig-、FITC、Cy5)抗衰老基因Klotho原位杂交图斑马鱼krox20基因原位杂交图3,5菱脑节厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术分子杂交技术FISH厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术生物芯片Biochip厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术生物芯片定义：在斑点杂交基础上，模拟制备大规模集成电路的基本原理，集成了探针原位合成、照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦显微技术发展来的一门分子生物学技术原理：将大量样本固定于较小的支持物上，然后与标记好的待测样品杂交，再检测杂交信号的强弱，从而判断样本中待测DNA、RNA、Pr等分子数量或活性状态特点：高通量、微型化、集约化、标准化等厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术生物芯片厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术生物芯片种类微阵列芯片（基因芯片/蛋白芯片/细胞芯片等）微流控芯片（属于主动式芯片，如样品制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等）芯片实验室（以生物芯片为基础的集成化分析系统;可完成如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术生物芯片基本流程：芯片制备原位合成法---原位光照蚀刻微量点样法样品制备（Sample-Cy3；Control-Cy5）分子杂交检测分析（Confocus、CCD）厚德博学精诚济世分子生物学第五章分子杂交技术生物芯片原位光照蚀刻原理石英片氢化后封闭设计11um见方窗口遮罩对封闭部分光解将nt加入通过化学偶合连接到晶片上更换不同的遮罩进行UV光解加入nt进行化学偶合反应重复上