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实时荧光定量PCR原理及应用MylabCorporation北京美莱博医学科技有限公司美莱博·我的实验室美莱博·我的实验室内容提纲„荧光定量PCR基础知识„SLAN荧光定量PCR仪„相关试剂‹MylabSmartGreen(20×)‹Mylab2×qPCRSmartMix„科研合作与技术服务美莱博·我的实验室常规核酸定量方法‹Southern杂交‹Northern杂交‹原位杂交‹传统RT-PCR‹半定量PCR存在的问题灵敏度准确性特异性时间美莱博·我的实验室实时荧光定量PCR„定义‹在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，昀后通过对未知模板进行定量分析的方法。‹利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。„目的‹对起始模板进行定量‹对某个基因进行快速/无污染的定性检测„优点‹灵敏,重复性,动态范围宽,高通量„原理‹C(t)值与起始模板浓度的对数成反比美莱博·我的实验室扩增曲线、荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：‰前6~15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值‰荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍‰手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光昀高值，同时要尽量选择进入指数期的昀初阶段，并且保证回归系数大于0.99‰真正的信号：荧光信号超过域值横坐标：扩增循环数Cycle；纵坐标：荧光强度。每个循环进行一次荧光信号的收集美莱博·我的实验室什么是C(t)值PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。美莱博·我的实验室为什么要引入C(t)值CtEndpoints相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定Ct值则极具重现性美莱博·我的实验室利用电泳定量11,500counts/5200counts=2.2folddifference美莱博·我的实验室实时荧光定量Ct18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifference美莱博·我的实验室如何定量标准曲线未知样品的C(t)值定量美莱博·我的实验室定量原理„理想的PCR反应：Xn=X0*2n„非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率美莱博·我的实验室定量原理„在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)Ex：扩增效率XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量；在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M„方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)„整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量美莱博·我的实验室定量原理„模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小„Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量Sample25美莱博·我的实验室常用的荧光检测方法„SYBRGreenI/SmartGreen„TaqMan®/TaqMan-MGB®„MolecularBeacons„MGBEclipseTMProbes„Lux®primers„Scorpions„Amplifluor„Q-Zyme„Others...dsDNADetectionTarget-specificDetectionQQR美莱博·我的实验室SmartGreen(双链DNA结合染料)ssDNA=freedye(weakfluorophore)dsDNA=Bindsminorgroove(intensefluorophore)美莱博·我的实验室SmartGreen工作原理SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation5’3’5’3’美莱博·我的实验室SmartGreen熔解曲线分析-dIdTTm温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)美莱博·我的实验室熔解曲线分析出现杂峰，其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物单一峰，无非特异性荧光，定量准确美莱博·我的实验室熔解曲线分析进行高分辨率熔解曲线（HRM）分析可以明显的区分三个不同的基因型：突变型（红色）、杂合型（紫色）和野生型（蓝色）。美莱博·我的实验室SmartGreen定量原理CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentration‰模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少‰Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量美莱博·我的实验室反应体系的建立及优化„SmartGreen使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测„Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准„MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM，以减少非特异性产物„反应Buffer体系的优化„反应温度和时间参数:由酶和引物决定„其他与常规PCR相同美莱博·我的实验室SmartGreen定量优缺点‰对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA‰使用方便-----不必设计复杂探针‰非常灵敏‰便宜优点‰容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性。但可以通过熔解曲线的分析，优化反应条件‰对引物特异性要求较高缺点美莱博·我的实验室TaqMan®探针未结合的探针探针、引物与目的片段结合，FRET光发射或者以热量形式散失Donordye(Reporter)Acceptordye(Quencher)LightEnergytransferTaqTaq水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离。每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqLightEmissionLight美莱博·我的实验室TaqMan法PCR反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5’→3’外切核酸酶活性在60℃昀高）也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S3、优化引物和探针浓度：获得昀小Ct值，昀大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同美莱博·我的实验室TaqMan法检测血液中的HBV数据分析分析结果：HBVDNA的精确copy数为3.7X105美莱博·我的实验室Taqman三通道实验HCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHIV-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpampliconDanielCandotti-Cambridge,UK美莱博·我的实验室Taqman优缺点‰对目标序列的高特异性------阴性结果确定‰设计相对简单------与目标序列某一区域互补‰重复性比较好优点‰只适合一个特定的目标‰委托公司标记，价格较高‰不易找到本底低的探针缺点美莱博·我的实验室Molecularbeacon法(分子信标)¾标记荧光的发夹探针¾环与目标序列互补¾茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂‰荧光共振能量转移（FRET）‰检测SNP昀灵敏的方法之一‰探针与DNA杂交时产生荧光-----变性过程：产生非特异性荧光-----延伸过程：不产生荧光------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号发夹型杂交探针美莱博·我的实验室标准品„绝对定量的标准样品‹已知拷贝数的质粒DNA‹体外转录的RNA‹绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，用到标准曲线„相对定量中的内标‹内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因‹在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小‹内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量‹相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异2-△C(t)双标准曲线法美莱博·我的实验室用于生成标准曲线的样品如何设定？„含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒„含有和待测样品相同扩增片段的cDNA„体外转录生成的RNA„紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度„根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释美莱博·我的实验室荧光定量PCR应用„特异核酸（基因）定性、定量‹RNA(cDNA)基因表达差异分析基因芯片结果验证‹DNA病原体定性与定量GMO(遗传改良组织)检测„序列特异性‹等位基因分型,SNP检测美莱博·我的实验室SLAN荧光定量PCR仪美莱博·我的实验室荧光定量PCR仪的硬件条件激发光源热循环－加热、制冷样品检测设备美莱博·我的实验室SLAN荧光定量PCR仪„优秀的光源系统‹高亮度的LED光源，光源稳定、集中、控制方便‹LED为冷光源，保证样品不会因光源的照射而产生温度的偏差‹LED的使用寿命长，可终身免维护„灵敏的光电探测系统‹采用的PMT（光电倍增管）光电探测器‹灵敏度高、快速、稳定„精确的温控系统‹采用半导体加热/制冷技术‹能精确、快速的控制温度的升降‹半导体控温精度可达±0.2度美莱博·我的实验室优秀的光源系统光源优点缺点卤素灯光强稳定光强不集中热量大，寿命短Shan灯亮度高光强集中需高压控制稳定性差，热量大，激光光源单色性好光强极强可选性差（尤其低波长）价格昂贵LED亮度高、稳定、控制简便、寿命极长、冷光源无明显缺陷美莱博·我的实验室灵敏的光电探测系统•PMT光电倍增管•冷CCD•CCD•Photodiodes光电二极管PMT冷CCDCCD光电二极管