1、总氮量的测定――凯氏定氮法

实验四总氮量的测定——凯氏定氮法目的和要求1.学习凯氏定氮法的原理。2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准梳酸铵含氮量的测定、未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。实验原理天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）的含氮量用凯氏定氮法来测定。当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下：测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的氢离子结全，生成铵离子，使溶液中氢离子浓离降低。然后再用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。本法适用的范围为0.2-1.0mg氮。相对误差应小于±2%。试剂①浓硫酸②硫酸铜③硫酸钾④氢氧化钠溶液：400g/L⑤硼酸吸收液：40g/L，称取20g硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。⑥HCl标准溶液：0.1000mol/L。⑦甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份2g/L溴甲酚绿95%乙醇溶液与1份2g/L甲基红乙醇溶液混合均匀。主要仪器：如图，凯氏定氮蒸馏装置。50mL消化管50mL容量瓶分析天平电炉小玻璃珠3mL微量滴定管烘箱1000mL蒸馏烧瓶远红外消煮炉实验流程样品消化蒸馏吸收滴定实验流程样品消化准确称取0.1g左右的干燥面粉作为本实验的样品。准备4个50ml的凯氏烧瓶，并标号，向第1、2号烧瓶内各加入样品0.1g，催化剂（K2SO4-CuSO4·5H2O）200mg，消化液5mL。注意加样品时应直接送入烧瓶底部，切勿沾于瓶口及瓶颈上。向3、4号烧瓶加入0.1ml蒸馏水和与1及2号瓶相同的催化剂和浓硫酸，作为空白对照，测量试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。小心摇匀后，按图安装消化装置，置于电炉上，在通风橱内加热消化。消化时先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力保持瓶内液体微沸，消化至溶液呈蓝绿色透明后，再继续加热微沸0.5h，取下冷却，小心加入20mL水，移入100mL容量瓶中，用少量水洗定氮瓶，并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。蒸馏、吸收取2～3个50ml的维形瓶，加入5ml左右2%硼酸-指示剂混合液，用表面皿覆盖备用。准确吸取10mL样品处理液由小漏斗流入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧玻璃塞。从安全漏斗中慢慢加入10mL400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。滴定全部蒸馏完毕后，用0.0100N标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。结果计算%10010000140100.0%/CBA）（克氮样品的总氮含量若测定的样品含氮部分是蛋白质，则有%1001000040100.0%/CBA克氮样品的总氮含量式中：A为滴定样品用去盐酸平均毫升数：B为滴定空白用去盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数；0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为系数（1ml0.01N盐酸相当于0.14mg氮）。若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测验定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含量氮量，得出非蛋白氮量及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步折算出蛋白质含量。蛋白氮=总氮-非蛋白氮蛋白质含量（克/%）=蛋白氮×6.25注意：蒸馏时实验室中切忌有碱性雾气（如氨），否则将严重地影响实验结果的准确度。若反应室内液体太多，超过1/2，又不易排出时，只能拆开仪器倒出贮液。但是一般尽量避免发生此种情况。折卸时应特别小心，防止损坏仪器。拆卸仪器应首先放松用来固定冷凝管的万能夹，然后小心地将冷凝管向下错开，待反应室外壳与冷凝管分开后，再移动反应室。“空白”滴定值包括水及氢氧化钠溶液中含有的微量的氨。因些，水质对“空白”滴定值的影响甚大。“消化样品”最后用“消化空白”进行校正计算，“不消化的样品”最后用“不消化的空白”进行校正计算。而且，在实验中，稀释样品的水与“空白”的水应当取自于同一瓶中。蛋白质是一类复杂的含氮化合物，其中每一种蛋白质都有恒定的含氮量，一般大约为14-18%，平均为16%。由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数6.25（即每含氮1g，就表示该物质含蛋白质6.25g）即为蛋白质量。最好将三氯乙酸沉淀的蛋白质部分再去消化，消化后测含氮量，这个含氮量应相等于由总氮及非蛋白氮计算的蛋白氮量。但操作麻烦一些。