第六章酶工程制药

1第六章酶工程制药2一、酶的特性1.概念：早期概念蛋白质现在的概念蛋白类酶（P酶）核酸类酶（R酶）DNA本质的酶D酶？？？第一节、酶工程简介（EnzymeEngineering）3R酶的种类1.分子内催化R酶Incis自我剪切酶（self-cleavageribozyme）自我剪接酶（self-splicingribozyme）2.分子间催化R酶IntransRNA剪切酶（RNAcleavagaribozyme）DNA剪切酶（DNAcleavagaribozyme）多肽剪切酶（peptidecleavagaribozyme）多糖剪接酶（polysaccharidesplicingribozyme）多功能R酶（multifuntionribozyme）其它R酶（otherribozyme）氨基酸酯剪切酶amino-acidestercleavagaribozyme4核酶的分类自1982年以来，被发现的核酸类酶（R-酶）越来越多，对它的研究也越来越深入和普遍。但是由于历史不长，对于其分类和命名还没有统一的原则和规定。但根据酶催化反应的类型，区分为分子内催化R-酶和分子间催化R-酶，根据作用方式将R-酶分为3类：剪切酶、剪接酶和多功能酶。5（1）分子内催化R-酶是指催化本身RNA分子进行反应的一类核酸类酶。是最早发现的R-酶。均为RNA前体。由于这类酶是催化本身RNA分子反应，冠以“自我”（self）字样。根据酶所催化的反应类型，可以将该大类酶分为两个亚类。①自我剪切酶（self-cleavageribozyme）是RNA的前体。它可以在一定条件下催化本身RNA进行剪切反应，使RNA前体生成成熟的RNA分子和另一个RNA片段。②自我剪接酶（self-splicingribozyme）是在一定条件下催化本身RNA分子同时进行剪切和连接反应的R-酶。也是RNA前体。它可以同时催化RNA前体本身的剪切和连接两种类型的反应。根据其结构特点和催化特性的不同，该亚类可分为两个小类，含Ⅰ型间隔序列（interveningsequenceIVS）的R-酶含Ⅱ型IVS的R-酶。6（2）分子间催化R-酶是催化其他分子进行反应的核酸类酶。根据所作用的底物分子的不同，可以分为若干亚类。①RNA剪切酶。②多功能R-酶是指能够催化其他RNA分子进行多种反应的核酸类酶。③作用于DNA的R-酶1990年，发现有些R-酶还可以DNA为底物，在一定条件下催化DNA分子进行剪切反应。④作用于多糖的R-酶该亚类的酶是能够催化多糖分子进行反应的核酸类酶。兔肌1，4--D-葡聚糖分支酶[EC2.4.1.18]是一种催化直链葡聚糖转化为支链葡聚糖的糖链转移酶，分子中含有蛋白质和RNA。其RNA组分由31个核苷酸组成，该RNA可以催化糖链的剪切和连接反应，属于多糖剪接酶。7⑤作用于氨基酸酯的R-酶1992年，发现了以催化氨基酸酯为底物的核酸类酶。该酶同时具有氨基酸酯的剪切作用、氨酰基-tRNA的连接作用和多肽的剪接作用等功能。由于蛋白类酶和核酸类酶的组成和结构不同，命名和分类原则有所区别。为了便于区分两大类酶，有时催化的反应相同，在蛋白类酶和核酸类酶中的命名却有所不同。例如，催化大分子水解生成较小分子的酶，在核酸类酶中的称为剪切酶，在蛋白类酶中则称为水解酶；在核酸类酶中的剪接酶，与蛋白类酶中的转移酶相似。82、特性1、高效性：2、专一性3、多样性4、温和性5、活性可调节性6.有些酶的催化性与辅因子有关7、易变性3、分类国际酶学委员会(E.C)规定1.氧化还原酶类2.转移酶类3.水解酶类4.裂解酶类5.异构酶类6.合成酶类(连接酶类)9二、酶工程简介通过人工操作获得所需酶并使其发挥催化功能的技术过程。酶的生产与应用的技术过程。主要包括生产1.药用酶:诊断、治疗、预防2.酶法制药:利用酶的催化功能经底物转化为药物的过程10酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶工程的名称出现在20世纪20年代初，主要指自然酶制剂在工业上的大规模应用。1953年，Grubhoger和Schleith提出了酶固定化技术。1969年，日本人用固定化酶技术技术拆分了DL-氨基酸。1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。11现代酶工程的主要内容a、酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；b、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；e、有机相中酶反应的研究；f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g、抗体酶、核酶的研究；h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。12第二节、酶的来源和生产菌1、酶的来源：提取分离、化学合成、细胞培养、微生物发酵13酶的生产目前多以直接从生物体中提取分离。早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物发酵法生产的。其特点是：A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都能从微生物中得到；B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提高酶的产量；C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌珠。142、酶的生产菌（1）对菌种的要求：a、产酶量高，酶的性质符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌；b、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生毒素；c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。15（2）生产菌的来源：a、菌种保藏机构和有关研究部门获得；b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移、基因克隆。16（3）目前常用的产酶微生物A、E.coli：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、β-半乳糖苷酶。B、枯草杆菌：主要用于生产α-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。C、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等。D、曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶E、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。17第三节、酶、细胞、原生质体的固定化（一）固定化酶的制备1、固定化酶（immobilizedenzyme）的定义:（1971年）指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。2、固定化酶的特点（1）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；（4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。3、酶和细胞的固定化方法（1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。18缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。（2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。（3）包埋法：A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。19B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。（4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。202122•4、酶和细胞的固定化载体•（1）吸附载体：无机物和有机物。•（2）包埋载体：卡拉胶、海藻胶•（3）共价结合载体：纤维素、SephadexA200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃。•载体应具备的条件：•（1）固定化过程中不引起酶变性；（2）对酸碱有一定的耐受性；•（3）有一定的机械强度；（4）有一定的亲水性和稳定性；•（5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀（6）共价结合时有可活化基团；•（7）有耐受酶和微生物细胞的能力：（8）廉价易得。•5、固定化酶的制备技术•（1）吸附法制备技术：将酶的水熔液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。•23242526纤维素）偶联再与酶偶联。27（二）固定化细胞的制备1、固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法，是第二代固定化酶。282、固定化细胞的特点（1）无需进行酶的分离纯化；（2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高；（3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高；（4）细胞内酶的辅因子可以自动再生；（5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应（6）抗污染能力强。3、固定化细胞的制备技术（1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。缺点：吸附容量小结合强度低。（2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。（3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。（4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。29(三)、固定化方法与载体的选择依据1、固定化方法的选择（1）固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。（2）固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。（3）固定化的成本：：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设备和劳务投资等。2、载体的选择为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化酶。3031原生质体固定化•（1)、原生